m6A RNA甲基化研究的数据挖掘思路：干货系列

关于m6A甲基化研究思路

（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析

（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示

（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略

（4）进一步验证或后期试验

PS：m6A、m1A、m7G等IP测序法的数据挖掘思路类似

一、m6A甲基化图谱分析

（1）m6A peak数量、m6A修饰基因数量的比较

m6A peak数量能反应样本整体的甲基化水平。

但峰数量差异不大并不能说明样本间甲基化图谱没有差异。

肌肉发育不同阶段m6A总数和修饰的基因总数的变化

不同组中检测到的m6A peak总数和m6A修饰基因总数的重叠分析 

（2）基因上m6A peak平均数量分析

基因的m6A peak数量分布与差异比较

（3）m6A peak在各基因元件上的分布

不同基因组元件（5’UTR、CDS和3’UTR）的m6A甲基化水平分布规律不同。

特别是在不同物种中，基因元件的甲基化水平可能自身的特点。

一般主要分布在CDS区和3‘UTR区

(4) m6A peak的motif分析

跟物种有关：

动物和酵母主要是RRACH（R = G or A；H = A,C, or U）

拟南芥和番茄主要是UGUAYY（Y = A, G, U, or C）

鸡脂肪组织

番茄果实

（5）m6A修饰基因的鉴定和功能分析

m6A修饰基因占所有基因的比例

m6A修饰基因的组间重叠分析

m6A修饰基因的功能分析

二、差异m6A peak分析

（1）非时间序列数据：

（2）时间序列数据：

（3）差异m6A peak关联基因的PPI分析

（4）感兴趣基因的差异m6A peak展示

三、组学关联分析：m6A甲基化组学&转录组学

（1）Meta genes整体关联

同一样本/组别内，所有基因的表达水平与对应基因的m6A富集程度、m6A peak数量进行关联。

组间的m6A peak变化趋势也可以关联。

转录水平 vs. peak富集程度

转录水平 vs. peak数量变化

转录水平倍数变化 vs. peak倍数变化

（2）DMG-DEG对应关联：筛选m6A修饰的关键目的基因

功能相关 差异显著

重叠分析

九象限图

四、进一步验证或后期试验

简单验证

全局m6A甲基化干扰实验（非靶向），验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能

靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验，检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达

研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达

m6A修饰目标基因的表达回复实验

研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达

关于RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术

MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。 大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。

适用于不同科研需求的MeRIP技术：

m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）

m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）

m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）

高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）

技术优势：

起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；

转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；

样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；

重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；

应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。

研究方向：

m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究

疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…

发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老

环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式