氧化应激刺激心肌细胞来源外泌体通过miR‑106b‑5p促进巨噬细胞M1型极化

李斌斌张学弟 朱志标 张良清

广东医科大学附属医院麻醉科，广东省湛江市器官功能损伤与保护转化医学重点实验室，湛江 524001

国际麻醉学与复苏杂志,2023,43(01):35-41.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20210726‑00711

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

探讨氧化应激刺激下心肌细胞释放外泌体对巨噬细胞极化的影响及其机制。

1 材料与方法      

取H9C2心肌细胞，采用随机数字表法分为0 μmol/L组、100 μmol/L组、200 μmol/L组、300 μmol/L组，分别用相应浓度H2O2处理后，各组使用细胞增殖‑毒性检测试剂盒（CCK‑8）检测细胞活力，Western blot法检测细胞活化形式胱天蛋白酶‑3（cleaved‑caspase‑3）、B淋巴细胞瘤‑2（Bcl‑2）、B淋巴细胞瘤‑2相关X蛋白（Bax）水平变化，流式细胞术检测细胞凋亡情况，根据检测结果选用最适处理浓度进行后续实验。

另取H9C2心肌细胞，参考经典的超速离心法，提取正常心肌细胞来源外泌体（NC‑exo）及氧化应激心肌细胞来源外泌体（H‑exo），透射电镜观察外泌体形态，Western blot法检测外泌体标志蛋白。激光共聚焦显微镜下观察巨噬细胞对外泌体摄取内化情况。

选取正常培养巨噬细胞，按随机数字表法分为对照1组（NC1组）、脂多糖1组（LPS1组）、正常心肌细胞来源外泌体预处理+脂多糖组（LPS+NC‑exo组）、氧化应激心肌细胞来源外泌体预处理+脂多糖组（LPS+H‑exo组）。LPS1组LPS处理6 h，LPS+NC‑exo组、LPS+H‑exo组分别加入NC‑exo、H‑exo预处理24 h再进行LPS处理6 h，NC1组不进行处理。使用Western blot法检测诱导型一氧化碳合酶（iNOS）、精氨酸酶‑1（Arg‑1）、CD86、CD206水平，使用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT‑qPCR）方法检测IL‑6、TNF‑α、趋化因子‑10（CXCL‑10）mRNA水平。采用RT‑qPCR方法检测外泌体miRNA表达量。

另取巨噬细胞按随机数字表法分为对照2组（NC2组）、脂多糖2组（LPS2组）、过表达阴性对照+脂多糖组（LPS+mimic‑NC组）、过表达miR‑106b‑5p+脂多糖组（LPS+106b‑mimic组）。LPS2组LPS处理6 h，LPS+mimic‑NC组、LPS+106b‑mimic组则分别使用转染试剂mimic‑NC、106b‑mimic转染24 h再进行LPS处理6 h，NC2组不进行处理。检测iNOS、Arg‑1、CD86、CD206水平及IL‑6、TNF‑α、CXCL‑10的mRNA表达水平。

2 结果     

2.1　氧化应激造成H9C2细胞死亡与0 μmol/L组比较：其余3组细胞活力下降（P<0.05，表1），凋亡相关蛋白Bax、cleaved‑caspase‑3水平升高，Bcl‑2水平下降（P<0.05，图1、表1），细胞凋亡率升高（P<0.05，表1）。选取200 μmol/L（H2O2）作为最适处理浓度用于后续实验（保持细胞凋亡率在20%~30%为宜）。通过显微镜观察，正常心肌细胞表现为梭形，而H2O2处理的心肌细胞可见皱缩变形、死亡（图2）。

2.2　200 μmol/L H2O2处理心肌细胞释放外泌体的鉴定Western blot法检测证明提取物符合外泌体特征（图3）。

透射电镜观察可见提取的纳米颗粒呈现圆形，并具有双层膜结构，粒子直径50~100 nm（图4）。

将荧光标记的外泌体加入巨噬细胞中共同培养24 h，可见大量外泌体被巨噬细胞摄取（图5

2.3　H‑exo对巨噬细胞极化的影响

与NC1组比较，LPS1组、LPS+NC‑exo组、LPS+H‑exo组iNOS、CD86蛋白水平升高（P<0.05），Arg‑1、CD206蛋白水平下降（P<0.05），IL‑6、TNF‑α、CXCL‑10 mRNA水平升高（P<0.05）。与LPS1组比较，LPS+H‑exo组iNOS、CD86蛋白水平升高，Arg‑1、CD206蛋白水平下降（P<0.05），IL‑6、TNF‑α、CXCL‑10 mRNA水平升高（P<0.05）。LPS+NC‑exo组与LPS1组差异无统计学意义（P>0.05）。见表2

2.4　两种外泌体中miR‑106b‑5p表达比较

与NC‑exo比较，H‑exo中miR‑106b‑5p表达升高［（2.7±0.5）比1，P<0.05］（NC‑exo表达量设置为单位“1”，计算H‑exo与NC‑exo的相对值）。

2.5　过表达miR‑106b‑5p对极化的影响

与NC2组比较，LPS2组、LPS+mimic‑NC组、LPS+106b‑mimic组iNOS、CD86蛋白水平升高（P<0.05），Arg‑1、CD206蛋白水平下降（P<0.05），IL‑6、TNF‑α、CXCL‑10 mRNA水平升高（P<0.05）。与LPS2组比较，LPS+106b‑mimic组iNOS、CD86蛋白水平升高（P<0.05），Arg‑1、CD206蛋白水平下降（P<0.05），IL‑6、TNF‑α、CXCL‑10 mRNA水平升高（P<0.05）。LPS+mimic‑NC组与LPS2组差异无统计学意义（P>0.05）。见表3、图7。

3 讨论     

本研究使用H2O2模拟心肌缺血再灌注时期发生的心肌氧化应激反应，在不同浓度H2O2处理下，通过CCK‑8、Western blot及凋亡流式结果选取合适的氧化应激模型，最终确定200 μmol/L浓度的H2O2作为恰当的刺激浓度用于后续实验。在此基础之上，提取NC‑exo及H‑exo，利用这些外泌体刺激小鼠单核巨噬细胞，结果发现，H2O2处理能进一步促进巨噬细胞向M1亚型分化，高表达M1型巨噬细胞标志蛋白，而正常心肌细胞来源的外泌体却不改变标志蛋白及炎症因子表达水平，反映了不同刺激情况下的心肌来源外泌体对巨噬细胞有不同的作用，因此，我们判断外泌体中携带物质的变化导致了巨噬细胞的不同极化。有研究表明，肿瘤细胞来源外泌体通过传递miR‑934诱导肿瘤相关巨噬细胞发生M2型极化，通过CXCL‑13/CXCR5/NF‑κB/P65正反馈途径促进肿瘤转移；同时，间充质细胞来源外泌体能通过miR‑182调控巨噬细胞中TLR4表达水平，介导巨噬细胞转化为M2表型，从而减轻MIRI。由此可见，不同细胞来源外泌体对巨噬细胞极化发挥不同的调控作用，在此我们成功验证不同状态下心肌细胞与巨噬细胞之间的关系。

我们在H‑exo中发现miR‑106b‑5p表达水平上升，由此推测在缺血再灌注损伤微环境中，心肌细胞可能通过外泌体传递miR‑106‑5p到达巨噬细胞，促进巨噬细胞的炎症反应，参与MIRI。为了进一步确认miR‑106b‑5p在巨噬细胞中的作用，我们构建了过表达模型，发现miR‑106b‑5p能够促进巨噬细胞M1型极化的发生，并且上调炎症因子表达水平。我们后续使用多种在线数据库（miRWalk、miRBD、Targetscan）对miR‑106b‑5p的靶基因进行预测，共筛选出421个潜在的靶基因（包括JAK1、PTEN、BNIP2等参与炎症调控重要基因）。可见，在心肌细胞发生氧化应激反应后，可通过释放外泌体参与巨噬细胞之间的沟通交流，促进巨噬细胞参与MIRI，加重心肌细胞损伤。但本研究仅使用了RAW264.7小鼠单核巨噬细胞，未使用功能和性质更符合小鼠本身生理功能的小鼠骨髓来源巨噬细胞实验，缺少一定的说服力。

综上所述，发生缺氧再灌注损伤的心肌细胞可通过外泌体传递miR‑106b‑5p介导巨噬细胞发生M1型极化，如能有效阻断其中的细胞间交互作用可为临床治疗MIRI提供更多的参考。

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