高通量测序后的下游实验验证方法——DNA甲基化

此前，我们分享了DNA甲基化研究的测序数据挖掘思路，进而鉴定出研究的目的基因或目标区域的DNA甲基化。

做完测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。DNA甲基化研究的后期验证包括简单验证、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证等。

一、简单验证

目标基因DNA甲基化的验证：Target-BS

检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR

检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

二、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）

DNA甲基化干扰：

DNA甲基化酶的敲降/敲除/过表达

DNA甲基化抑制剂

阿扎胞苷（5-Aza）能够通过与DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共价键抑制其酶活性，使细胞的DNA甲基化水平降低。

检测整体DNA甲基化变化：

5mC甲基化免疫荧光染色（定性）

DNA斑点杂交（定性）

比色法（定量）

质谱法（定量）

检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS

检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR

检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

三、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证

目的基因DNA甲基化的干扰：

荧光素酶活性分析实验（Luciferase activity assay）：使用CpG甲基转移酶在体外将质粒进行甲基化，构建含甲基化/未甲基化启动子的目标基因-荧光素酶表达质粒。

CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化实验：在细胞中人为表达目的基因，或通过CRISPR-Cas9系统靶向编辑DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修饰。

检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS

检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR

检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

检测细胞功能受到的影响:

免疫荧光显微观察

功能标志物测定

... ...

CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化技术

目标区域DNA甲基化的验证手段——Target-BS（靶基因重亚硫酸盐测序）

靶向特定区域进行超高深度甲基化测序。

超高深度：可达几百到几千乘。

单个区域长度<300bp

需要设计BS引物，进行预扩增实验。

WGBS vs. TBS相当于RNA-seq vs. RT-qPCR

对目标基因/CpG 位点甲基化检测，建立灵活的靶向甲基化测序技术。建立的靶基因甲基化高通量测序（Target Bisulfite sequencing，Target-BS）是针对已有目标基因panel组合，运用易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件，对亚硫酸盐转化后的目标基因多重扩增，建库后进行超高深度（1000X以上）甲基化精准检测。

应用方向：

Target-BS广泛用于已知位点的甲基化Biomarker筛选、验证及临床转化应用

后续目标基因的甲基化验证

技术优势：

多基因多重扩增，检测通量高；

超高深度亚硫酸盐甲基化测序，相对于传统BSP克隆测序，检测灵敏度、准确性高，可准确检测到样本中低于1%的甲基化水平；

样本需求量低，20ng基因组DNA可实现多基因扩增；

适用范围广，对基因组DNA、FFPE样本、游离cfDNA等样本均适用；

检测费用显著低于现有技术、快周期、超高性价比。

典型案例：

Target-BS用于甲基化多位点甲状腺结节诊断

Target-BS发现食管鳞癌甲基化 biomarker

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