“液体活检”的基石：高质量游离DNA的获取

近年来，随着精准医学的发展，尤其是靶向药物与免疫治疗成为癌症治疗领域的受捧对象，液体活检这一检测技术备受关注，与传统的组织活检相比，液体活检凭借其无创性、敏感性、动态性等特质，被寄予厚望。

当我们在讨论液体活检的时候，离不开生物标志物，也就是液体活检的三驾马车：循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、细胞外囊泡（EVs，主要是外泌体）。高质量的生物标志物的获取，才能确保液体活检的顺利开展。因此，采血的质量也就是其后所有检测流程的基础。而真空采血管，作为高效的采血工具，发展至今已有80多年，为所有光鲜的新技术铸就了坚实的基石。

液体活检发展史中的采血管

液体活检的发展史就是一部采血管的进化史，采血管的进步也推动了液体活检的发展。液体活检的历史一般可追溯到1869年：澳大利亚医生Thomas Ashworth在刚去世的肿瘤患者血液中发现和肿瘤细胞相似的细胞（如图1所示）1，猜测肿瘤细胞会随血液循环移动，这可能解释了为什么该患者身上有多处肿瘤转移。这也是肿瘤循环细胞（CTCs）的概念首次被提出2。

而此时，真空采血管尚未问世，此后的100年里，从注射器采血、空心针、EDTA抗凝管、肝素抗凝管的发明，到1997年卢煜明检测怀孕妇女血液中胎儿的cfDNA时，分别用EDTA管和普通管采血。其后陆续几篇方法学文章，基本确认了逐步确立了使用EDTA管取血、离心，从血浆中提取cfDNA的标准流程。

Thomas Ashworth 1869年发表在澳大利亚医学期刊上的描述肿瘤循环细胞的文章

EDTA可以螯合Ca2+起到抗凝作用，防止凝结过程中白细胞裂解释放出DNA；还可以结合其他二价金属离子，抑制各种金属依赖酶的活性，其中包括抑制核酸酶，减少cfDNA降解；另外，EDTA不会像肝素一样干扰PCR的扩增。但是不管用什么管采血，都需要及时（<6小时）分离血浆(血清)，否则血液中的有核细胞会死亡凋亡裂解释放DNA污染cfDNA。这要求血液在采血点即时处理，无法远距离运输到检测中心集中处理，这对液体活检的应用造成了极大的限制。

专用采血管发明，液体活检发展进入快车道

目前游离DNA检验应用于临床常规的瓶颈主要集中于方法学和样本的质量上，由于血浆中存在的靶cfDNA微乎其微，标本的采集、抗凝剂使用和保存的不当都会影响检测的质量，造成假阳性或假阴性的结果。cfDNA的大小一般为150～210000bp，片段之间，差异较大。ctDNA的片段大小一般为166bp，其半衰期为16min～2h不等。因此，在cfDNA的相关检测中，对样本的完整性和检测灵敏度都提出了极高的要求。

自2010年起，Streck、PAXgene、Roche和BD等国外医疗设备龙头企业相继推出了无甲醛的cfDNA专用采血管，可以避免细胞来源基因组DNA污染，防止样品中cfDNA降解，同时防止cfDNA发生与其它生物大分子(如蛋白)交联3。尤其是2011年临床批准的NIPT技术开始，基于cfDNA的液体活检技术蓬勃发展。

除了cfDNA外，研究人员还可以利用血液中的cfRNA、外泌体、TEP等成分进行液体活检。

参考资料：

1.Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death. Aust Med J 14, 146 (1869).

2.Nieva, J. J. & Kuhn, P. Fluid biopsy for solid tumors: a patient’s companion for lifelong characterization of their disease. Future Oncol. 8, 989–998 (2012).

3.Norton, S. E., Lechner, J. M., Williams, T. & Fernando, M. R. A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR. Clin. Biochem. 46, 1561–1565 (2013).

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