8+！基于癌症功能状态的胃癌分子亚型~

导语

胃癌 (GC) 是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因。胃癌的治疗仍然是一个挑战。

背景介绍

今天小编为大家了一篇基于癌症功能研究胃癌分子亚型的文章，文章发表在《Journal of Translational Medicine》，影响因子为：8.44，文章题目为：Cancer functional states-based molecular subtypes of gastric cancer。

数据介绍

本研究从TCGA数据库下载 了TCGA-STAD 队列的基因表达谱、体细胞突变、拷贝数和临床数据。

从GEO数据库中下载了GSE62254、GSE15459、GSE57303 和 GSE34942的表达数据并合并为一个数据集，命名为 GPL570 数据集。选择来自 GSE183904 的单细胞序列数据进行进一步分析。

技术路线          

本研究技术路线如图所示   。  

结果解析 

01   癌症功能状态确定三种GC亚型  

基于 GSVA 方法计算的 14 种癌症功能状态评分，本研究使用共识聚类方法将 TCGA-STAD 数据集分为 3 个亚型 （图 1A）。通过主成分分析发现聚类1（C1）和聚类2（C2）可以明显分离，而聚类3（C3）分布在两个亚型之间，似乎C3是过渡特征的类别（图1G）。KM分析显示C1的生存预后往往较差，C2的生存预后最好， C3无显著生存差异，但曲线趋势显示C3总生存时间介于C1和C2之间（图2B）。C1细胞周期、DNA损伤和DNA修复表达低，其余11种癌功能状态水平低，C2与C1正好相反，C3 在所有癌症功能状态中都具有高水平（图 1A）。在 GPL570 数据集和 GSE84437 中也观察到了类似的结果（图 1C-F、H、I）。

图 1

02   三种GC亚型的信号通路和免疫细胞  

为了探索三种亚型之间的功能状态，本研究使用 GSVA 方法计算了所有KEGG信号通路的分数。结果显示几乎所有与代谢相关的KEGG信号通路都在C3中高表达，表明C3细胞处于高水平代谢状态。4 种能量代谢通路（糖酵解/糖异生、柠檬酸循环、磷酸戊糖通路和氧化磷酸化）的活动是：C1 < C2 < C3（图 2A）。免疫相关通路分析表明，C3的免疫活性最高，其次是C2，C1最低（图 2B）。此外，本研究还分析了 10 条与癌症相关的信号通路的表达，所有通路都在 C3 中高表达（图 2C）。

图 2

接下来本研究通过 ESTIMATE 算法计算了免疫和基质评分。与信号通路分析的结果类似，这些数据证实 C1 和 C2 分别具有最高和最低的免疫评分、基质评分和 ESTIMATE 评分（图 2D）。此外，本研究还使用了 CIBERSORT 算法来估计 GC 样本中 22 种免疫细胞的比例。C1 的特点是高 B 细胞幼稚、B 细胞记忆、浆细胞、T 细胞 CD4 记忆静息、T 细胞调节（Tregs）、树突状细胞静息和肥大细胞静息（图 2F）。C3 非常富含 T 细胞 CD4 记忆激活、T 细胞滤泡辅助细胞、NK 细胞静息、NK 细胞激活、巨噬细胞 M0、巨噬细胞 M1、巨噬细胞 M2 和中性粒细胞（图 2F）。C2 的特点是所有免疫细胞的浸润度较低。此外，为了评估 GC 样本的免疫细胞溶解活性，本研究分析了三个亚组之间 IFN-γ 和 TNF 信号通路的差异。有趣的是，C3 在这两个分数中最高，表明 C3 具有最强的免疫细胞溶解活性（图 2E）。

03   三种GC亚型的基因组改变  

为了探索三种亚型之间的基因组差异，本研究分析了 TCGA-STAD 的 CNV 图谱 ，阈值为 q < 0.05。去除种系 CNV 后，结果发现与 C1 和 C2 相比，C3 具有较低水平的手臂和焦点水平 CNV（图 3A-C）。此外，与 C1 相比，C1 和 C2 的染色体不稳定 (CIN) 患者比例更高（图 3D）。上述结果表明C3具有更好的基因组稳定性。

图 3

接下来，本研究分析了三种亚型之间基因突变的差异 。分析了三个亚型中突变频率前20位的基因，其中13个（TTN、MUC16、FAT3、LRP1B、SYNE1、CSMD3、PCLO、FAT4、DNAH5、ZFHX4、RYR2、CSMD1和KMT2D）在所有GC样本中突变频率最高的20个基因中（图 3F、G）。本研究还发现C3的突变频率高于C1和C2，C2的突变频率高于C1。这与微卫星不稳定 (MSI) 患者在三种亚型中的分布一致（图 3D）。这也得到了三组肿瘤突变负荷 (TMB) 差异的支持（图 3E）。这些结果表明基因突变可能与 GC 亚型的表型有关。

04   肿瘤功能状态评分可作为预后的标志  

由于本研究观察到亚型间OS有显著差异，因此认为癌症功能状态评分是否可以作为预后的标志。在获得TCGA-STAD队列所有样本的14个基因集评分后，LassoCox 算法用于识别用于预后预测的最稳健的癌症功能状态通路(图 4A)。最后，建立与癌症功能状态通路相关的风险模型为: -0.00135455854945771*Cell Cycle-0.416041346360079*DNA damage+ 0.4 406743557326 46*缺氧+ 0.10833269488575*侵袭。如图 4B所示，KM分析显示TCGA-STAD患者风险评分越高总生存期越差。为了验证模型的稳定性，本研究在另外两个队列中进行了分析，在GPL570队列和GSE84437中也观察到类似的结果(图 4C, D)。

图 4

05   基质细胞主导癌症功能状态  

由于肿瘤组织不是由单一类型的细胞组成，包括上皮细胞、免疫细胞和间充质细胞，因此有必要探索GC亚型中各种细胞类型之间的差异。 本研究认为通过计算每个单细胞样本中所有细胞的平均基因表达量，可以获得近似批量水平的测序结果。本研究首先将TCGA-STAD按照7:3随机分成两部分，前者作为训练队列，后者作为验证队列。然后根据 14 项癌症功能状态评分在训练数据集中对模型进行训练，然后使用训练好的模型预测单细胞队列样本的GC亚型，最终得到C1患者13例，C2患者11例，C3患者2例。

癌症功能状态的分布特征也与 TCGA-STAD 队列的分布特征一致（图 5A），这证明了分类器的稳健性。基于0.8的res，共获得27个细胞簇（图5B）。然后本研究确定了五种主要细胞类型，包括上皮细胞、T 细胞、B 细胞、基质细胞和骨髓细胞（图 5C）。这些癌症功能状态评分的热图在基质细胞中显示出主要的高评分（图 5D）。因此，本研究接下来分析了三种亚型之间基质细胞的差异。

图 5

基质细胞可以重新聚类成 14 个簇，res 为 0.3。本研究将这些基质细胞注释为周细胞、肌癌相关成纤维细胞 (myCAF)、未定义的癌症相关成纤维细胞 (undefinedCAF)、炎症性癌症相关成纤维细胞 (iCAF) 和内皮细胞（图 5E）。值得注意的是，myCAF 是 C1 亚型的特定细胞类型，这意味着 myCAF 可能参与了 C1 亚型相关特征的形成（图 5E、F）。本研究对 myCAF 的标记基因进行了 KEGG 通路富集分析，结果表明myCAF处于相对活跃状态，这可能与其促瘤作用有关，与C1预后最差一致（图 5G、H）。KM 分析还表明，具有高 myCAF 浸润的 GC 患者的 OS 较差（ 图 5K）。本研究分别研究了内皮细胞、iCAF 和周细胞的发育轨迹，在内皮细胞和周细胞中，没有发现三个簇之间明显的轨迹变化，只有 iCAF 中存在 C1-C2-C3 的发育模式（图 5J）。本研究还在 iCAF 中进行了场景分析，结果表明 MAFK 和 TWIST2 在 C3 中被高度激活（图 5I）。先前的研究表明，这两种转录因子诱导 EMT，然后促进肿瘤进展，这与 C3 中的高 EMT 评分一致（图 5L）。同时本研究还发现高 iCAF 浸润意味着更差的 OS，这可能与 iCAF 促进肿瘤进展的能力有关（图 5M）。在 TCGA-STAD 队列的三种亚型中，iCAF 浸润在 C1 中最高，在 C3 中最低（图 5N）。

06   C3对免疫治疗有较好的反应  

本研究将T细胞标注为CD4 + T细胞、CD8 + T细胞、NK T细胞、调节性T细胞(Tregs)和增生性T细胞(图 6A)。由于T细胞在抗肿瘤免疫中起着重要作用，本研究接下来研究了T细胞在三个亚型之间的特征异质性，不同类型T细胞的数量在三种亚型间无明显差异(图 6B)。为了研究三种亚型T细胞的细胞毒性差异，本研究重点研究了CD8 + T细胞和NK T细胞，结果发现C3具有更强的肿瘤杀伤活性，无论是IFN-γ通路和IFNG基因的表达还是细胞毒性评分(图 6C, D)都证明了这一点，C3的NK T细胞似乎比C1和C2具有更显著的肿瘤杀伤活性(图 6C, D)。

图 6

既然C3具有最强的抗肿瘤能力，本研究接下来分析三种GC亚型是否对免疫治疗有不同的反应。在CD8 + T细胞中，C3具有更高的衰竭评分和免疫检查点基因表达(PDCD1, LAG3)，这证明C3可能对免疫治疗有更好的反应(图 6E)。在整体水平上，C3的TIDE评分也高于C1和C2，这与本研究在单细胞分辨率上的发现一致(图 6G)。本研究还分析了接受免疫治疗的尿路上皮癌队列中三种亚型之间的差异。首先根据之前建立的亚型预测模型将IMvigor210队列中的患者分为三种亚型，这三种亚型也与之前的胃癌队列具有相同的特征分布(图 6F)，并具有相同的生存差异(图 6H)。C3免疫治疗应答者的比例明显高于C1和C2，尤其是完全应答者的比例(图 6I, J)。

07   亚型相关的治疗策略  

化疗是癌症治疗的重要策略，本研究将癌症基因组计划(CGP)数据库用于预测化疗反应。结果显示，5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、丝裂霉素C和紫杉醇更适合C1患者(图7)。

图 7   

小编总结

本研究根据14种癌症功能状态将胃癌分为3个亚型。从信号通路水平、基因组改变水平和单细胞水平阐明了三个亚型之间的特征差异。发现C3对多种化疗药物更敏感，可以从免疫治疗中获益。这为胃癌的临床治疗提供了新的思路。不过本研究的结论仍然需要更多的数据进行验证，总之本研究为癌症亚型分析提供了一套思路，值得大家学习！