工程可溶性T细胞受体治疗

靶向肽-人白细胞抗原（pHLA）复合物的免疫治疗方法正变得非常有吸引力，因为它们有可能获得几乎所有的外来和细胞蛋白。出于这个原因，人们对pHLA的天然配体（TCR）的开发有相当大的兴趣，T细胞受体（TCR）作为可溶性药物可靶向出现在细胞表面的与疾病相关pHLA。然而，天然TCR稳定性对于可溶性药物开发来说是次优的，天然TCR通常对pHLAs具有较弱的亲和力，限制了它们作为可溶性药物达到有效受体占用水平的潜力。为了克服这些限制并充分利用TCR作为可溶性药物平台，已将几种蛋白质工程解决方案应用于TCRs，以提高其稳定性和亲和力，重点是保持靶标特异性和选择性。本文回顾了这些进展，并展望了下一代可溶性TCR疗法的未来，这种疗法可以靶向同时呈现肽和非肽抗原的单态类HLA蛋白。

介绍

近年来，人们越来越关注人白细胞抗原（HLAs）作为免疫治疗的靶标，因为它们可以在细胞表面呈现降解蛋白质的片段，代表几乎所有的细胞内和细胞外蛋白质（图1）。因此，这些pHLA复合物可以作为感染期间外源蛋白表达、癌症中蛋白质失调/突变、以及自身免疫中自身蛋白识别的“细胞窗口”。然而，靶向pHLA带来了一些固有的蛋白质工程挑战。首先，疾病相关的pHLA可以在靶细胞上以非常低的水平存在（每个细胞通常低于每个特定肽表位的10个拷贝），代表任何可溶性靶向分子的受体占用挑战。其次，HLA是一种由几乎所有有核细胞表达的自身蛋白，因此肽依赖性识别对于避免广泛的靶向毒性至关重要。第三，HLA是高度多态的，这可能会限制基于遗传背景的患者覆盖范围。

图1  TCR配体的递呈途径。示意图显示了HLA I类（经典）、HLA-E、CD1和MR1的简化抗原呈递途径和细胞表面表达。HLA或HLA样分子呈绿色和青色，肽配体以红色显示，代谢物配体显示为黑色线条，脂质配体以黑色表示，以卡通形式表示脂质尾巴和头部组

天然pHLA配体是T细胞受体（TCR），这是一种膜跨蛋白，由两条链（α和β）组成，每条链形成两个结构域（恒定:C和可变:V）。TCR识别由两个平行的α螺旋组成的连续pHLA表面，其肽结合在它们之间形成的裂隙中。结构研究表明，TCR两条链的可变结构域直接与所呈现的肽中暴露的残基和HLA结合槽表面相互作用。这些相互作用通过三个互补决定区（CDR）环将TCR对角定向到pHLA表面，每条链有两个种系编码（CDR1和CDR2）和一个超可变（CDR3），介导相互作用。通常，与肽中心溶剂暴露区域的相互作用由TCR的超可变CDR3环主导，而与N和C肽末端的额外相互作用通常分别由CDR1α和CDR1β环产生。相比之下，CDR1和CDR2环通常构成与HLA螺旋的大部分接触，CDR3环的不同程度的贡献水平通常由TCR定位和CDR3环长度的微小差异决定。

本文中，将讨论与使用可溶性TCRs靶向pHLA相关的一些挑战，并重点关注设计这些受体的解决方案，这些受体具有产生有效可溶性治疗分子所需的属性。考虑优化TCR治疗的稳定性/可发展性、亲和力和特异性的方法。已经在ImmTAC（免疫动员单克隆抗癌TCR）分子的产生中实际实施了许多这些方法，其组成了单价亲和力增强的TCR（KD~ pM范围）融合到单价抗CD3单链Fv抗体片段。这些可溶性治疗性双特异性通过亲和力增强的TCR-pHLA相互作用修饰肿瘤细胞，使T细胞通过CD3参与重定向杀伤肿瘤细胞。重要的是，工程TCRs的非常强的亲和力，加上通过抗CD3部分的有效触发，使T细胞能够针对低水平表达的肿瘤相关pHLAs的肿瘤细胞进行重新定向。最后，考虑了与用可溶性TCRs靶向单态类HLA样分子相关的机遇和蛋白质工程挑战，这些TCRs分子具有访问不同类别的抗原（包括脂质和代谢物）的潜力，并且不受遗传背景的限制。

可溶性TCRs的天然稳定性差和微摩尔结合亲和力不利于可溶性疗法的开发

已经发现天然TCR作为可溶性分子相对不稳定，可能反映了它们在细胞表面作为跨膜蛋白的自然表达。这种特性使这些蛋白质作为可溶性试剂的治疗发展复杂化。此外，尽管在TCR-pHLA蛋白-蛋白界面处产生的埋藏表面积很大（约2000 Å2平均而言），但与其他Ig样蛋白相比，自然测量的结合亲和力相对较弱（KD ~0.1-1000μM）。对肿瘤相关pHLAs具有选择性的TCRs倾向于向该范围的较弱端结合，可能代表胸腺缺失与自身衍生肿瘤肽结合的TCR，增加了TCR选择的挑战及其作为该疾病领域治疗的效用。

虽然尚未完全理解为什么TCRs被自然选择具有这些结合特征，但有人提出，弱亲和力可能使TCRs能够与数千甚至数百万肽发生交叉反应，以提供针对所有可能的外来抗原的足够免疫覆盖，并且弱亲和力是最佳T细胞触发所必需的。在双特异性T细胞接合剂的情况下，通常使用抗CD3抗体作为效应部分，T细胞触发然后变得依赖于抗CD3-CD3相互作用的结合亲和力和动力学。从理论上讲，这种相互作用应该能够在重定向的T细胞上连续触发TCR-CD3复合物（即足够弱的亲和力以允许多个TCR-CD3复合物的连续接合），并且应该满足动力学校对模型的标准（即TCR必须接合足够的持续时间以允许信号启动）。还观察到，用对其配体具有强亲和力的嵌合抗原受体（CAR）转导的T细胞穿透实体肿瘤的能力有限，这表明弱TCR亲和力可能使T细胞脱离中和靶标，从而能够连续杀死其他细胞并增加对组织的渗透。无论天然TCR亲和力弱的生物学原因是什么，设计基于TCR的可溶性pHLA靶向双特异性的结果是，由于观察到许多疾病相关pHLA的自然表现水平非常低（通常在每个细胞10多个拷贝中），需要在飞摩尔到皮摩尔的亲和力范围内结合以实现治疗相关的受体占用水平。

考虑到与天然TCR相关的固有问题，直接靶向pHLA作为可溶性疗法的明显替代方案（鉴于20年的研发以及经过验证的稳定性和药代动力学特性）是使用抗体，抗体作为可溶性分子天然稳定，并且通常对其靶标具有更强的天然亲和力。然而，尽管有丰富的学术文献和一些商业努力，还没有临床数据可用于可溶性单克隆抗体的双特异性分子靶向pHLA（所谓的TCR模拟抗体）。一个可能的困难是这些试剂的特异性。事实上，我们最近证明，与TCR通常采用的更广泛的结合模式相比，一些TCR模拟抗体与热点驱动的能量结合模式结合。因此，TCR模拟抗体具有最小的肽基序，导致与TCR相比识别多样化的肽库，导致对靶阴性健康细胞系的交叉反应性。这些观察结果强调了将TCR设计为可溶性药物时要考虑的最后一个问题：TCR被胸腺选择，具有结合特性，使其能够识别外来pHLA，同时保持对自身pHLA的耐受性。即使在胸腺选择之外对TCR进行微小的修改也可能产生不可预测和不必要的后果。因此，对控制TCR-pHLA相互作用的参数有深入的了解至关重要，这样界面就可以以智能的方式进行修改，从而产生具有有利治疗特性（稳定且具有强亲和力）的分子，同时对预期靶标保持选择性。

工程稳定、可溶TCR

如前所述，其较差的天然稳定性/溶解性限制了将TCR作为可溶性实体进行研究的范围，对设计一种治疗性可溶性分子形式具有明显的连锁反应。与抗体相比，这反映在相对较低的表达产量，可溶性TCR观察到相对较高的错误折叠和聚集水平，以及使用蛋白质显示平台的表达较差。另一个尚未得到正式证实的令人困惑的观察结果，但通过证明细胞表面优先TCR表达的研究强烈暗示，尽管在免疫库中明显无偏倚的配对行为，但某些TCR Vα-Vβ配对似乎比其他TCR Vα-Vβ配对更相容于可溶性分子。单细胞RNA测序的最新进展越来越多地用于研究配对αβTCR序列的特异性，代表了通过鉴定TCR Vα-Vβ配对来指导进一步工程工作的潜在资源，这些TCR Vα-Vβ配对更有可能产生稳定、特异性、可溶性试剂。下文将讨论最近解决这些问题和细微差别的历史和方法。

产生可溶性 TCR 的早期尝试

由于两个分子之间的序列和结构相似性程度高，最初产生可溶性TCRs的尝试遵循与产生可溶性单链Fv抗体相同的策略。已经报道了几种连接Vα和Vβ结构域的方法，用于大肠杆菌表达和酵母展示，其中最常见的是TCR Vβ C末端和TCR Vα N末端之间的25aa连接子（图2）。然而，大多数仅包含与Vα结构域相连的Vβ结构域的scTCRs被发现可溶性差，表达非常低，可能是由于暴露于通常由C结构域掩埋的几个表面疏水性残基。因此，计算建模和通过酵母展示或噬菌体展示的随机诱变已被用于识别有益的突变，包括主要在Vα-Cα或Vβ-Cβ界面上替换表面暴露的疏水残基，在Vα-Vβ界面引入稳定突变，在超可变4 Vβ环中突变，或使接头序列刚性的改变（图 2）。然而，由于Vα/Vβ种系的高度多样性，这些突变通常是单个TCR的独特解决方案，限制了普遍有益的突变的识别。因此，对于生成的每个scTCR，可能需要结构引导的方法和/或在大型展示库中使用随机诱变，以产生稳定的可溶性分子。

图2  稳定和溶解TCR分子的蛋白质工程方法。示意图显示了用于提高TCR分子稳定性和溶解度的不同策略。TCR 以蓝色显示，修改后以橙色显示。修改类型分为可以普遍使用的修改类型（即不依赖于Vα-Vβ配对）和定制类型（即依赖于Vα-Vβ配对）。

TCR C区的通用稳定

后来开发了使用天然四结构域的VαCα和VβCβ结构的替代方法（从而绕过V结构域中暴露疏水性残基的问题），为稳定可溶性TCRs提供了更通用的方法。这涉及人为改进，通过将免疫球蛋白kappa恒定结构域融合到这两个恒定结构域的C末端或在TCR C末端插入jun-fos亮氨酸拉链来帮助细胞外α和β结构域的配对（图2）。亮氨酸拉链法允许TCR作为昆虫细胞中的均一产物表达，与没有工程结构域的表达相比，产量显着提高。这种亮氨酸拉链策略后来被改编为大肠杆菌作为包涵体的表达，其中TCR被成功折叠用于生物物理分析。然而，由于亮氨酸拉链的长度和灵活性，这种方法不太适合使用X射线晶体学的结构研究或用于治疗开发。因此，在两个TCR C结构域之间开发了一种新的链间二硫桥（Boulter二硫化物），从而能够从重折叠的包涵体中产生相对高产的稳定可溶性蛋白质（图2）。由于这种方法不需要包含任何非结构化连接子，因此它成功地被用于更高通量的结晶筛选和可溶性TCR双特异性的产生。

使用计算和蛋白质显示方法定制单个TCR的稳定性

尽管上述详细介绍的方法通常增强了我们产生用于研究和治疗开发的可溶性TCR的能力，但通过对单个TCR进行定制修改，仍有很大的改进空间。例如，已知V结构域配对的性质会影响TCRs的呈递和表面稳定性，这表明更有针对性的方法可能对某些TCRs有益，以充分优化其稳定性以用作治疗药物。最近的一项研究发现了多个显性TCRs（包括编码TRAV38-1，TRAV38-2，TRBV5-1和TRBV7-8的TCR），当被引入的合成TCR挑战时，它们在细胞表面显著富集，这表明这些配对以优先方式发生。虽然没有研究对可溶性TCR稳定性的影响，但使用结构建模和突变筛选来证明，通过引入主要TCR对中存在的三种残基：L96α（导致Vα-Cα界面稳定）和R9β / Y10β（导致Vβ-Cβ界面稳定）可以挽救低表达TCR的细胞表面表达水平。此外，最近对晶体结构和计算机建模的计算分析已经成功地提高了可溶性TCR异源二聚体的产量和稳定性，即使在没有工程化的Boulter二硫键的情况下也是如此。对整个C结构域进行计算筛选，以找到预测替代残基以稳定TCR的位置。有趣的是，许多选择的突变被证明可以定位到溶剂暴露的表面并改变链内Cα-Cα和Cβ-Cβ，以及链间Cα-Cβ相互作用。虽然预测改善整体稳定性的单个突变只会导致对热变性和哺乳动物表达滴度的抗性略有增加，但结合几种突变导致显著改善，最佳全长TCR的熔点升高8.5°C。另一项建立在已经含有Boulter二硫键的支架上的研究通过算法确定了潜在的额外二硫键，这些键可以基于现有的晶体结构数据放置在TCR C结构域内或V-C界面上。尽管添加这些额外的二硫键仅显示出热稳定性的增量改善（使用差示扫描量热法测定+1-3°C），但该方法突出了对某些Vα-Vβ对进行微调的额外潜力。

除了这种合理的结构引导工程之外，定向进化在鉴定TCRs中的稳定突变方面也取得了丰硕的成果。需要对单链小鼠2C TCR的框架区域进行容易出错的PCR来发现突变，这允许在酵母上合理地表面显示（与可溶性分子的稳定性相关），增加表面显示和热稳定性的突变主要发生在Vα和Vβ区域之间的界面。针对该界面的更复杂的文库设计确定了一种单点突变，该突变通过域间界面的变构“远程”驱动机制增强了热稳定性和结合亲和力，这种现象也见于抗体。这些发现表明，TCR稳定性和TCR-pHLA亲和力是相关的，这对于设计蛋白质工程解决方案以产生亲和力增强的TCR具有重要意义。在另一项研究中，具有框架突变的scTCR文库通过噬菌体显示并筛选以改善热稳定性。这些研究确定了小鼠4B2A1 TCR Vβ（L214S）中的显性突变，该突变用亲水性氨基酸取代了疏水性表面暴露的氨基酸，从而增加了对变性的抵抗力并改善了可溶性周质表达产量。

小结

在最近的TCR工程出版物中，一个共同点是将结构引导的信息与大规模筛选技术相结合，以创建有针对性的文库建设方法。

Froning和Harris的工作始于对单个点突变的系统筛选，以识别改善结合和/或稳定性的单个残基变化。使用计算或物理深度突变扫描可以识别关键残基，以优先进行组合筛选。如上所述，最成功的TCR稳定性和亲和力工程来自TCR特异性突变，对这种多样化的分子类别具有有限的普遍适用性。在没有任何新颖的工程策略（如Boulter二硫键）的情况下，TCR工程的未来可能依赖于优化定制链或链对特定的支架，需要更多地使用计算机建模和更复杂的更高通量筛选工具。此外，TCR工程领域的进步，以及更多的结构和实验信息，应该能够开发更复杂的预测工具，用于评估不同TCR序列的稳定性和一般可开发性，就像抗体领域的情况一样。

工程TCR亲和力

已经采用了几种不同的策略来增强TCR-pHLA相互作用的天然弱亲和力。这些方法大致分为两个阵营：①结构指导的生物计算亲和力成熟和②使用哺乳动物、酵母或噬菌体展示库的定向进化（表1）。在计算方法中，通常使用TCR-pHLA复合物的分子动力学模拟，包括自由能计算，以模拟界面处可能增加结合强度的突变。尽管在计算方法中取得了成功，但它们已经产生了相对适度的亲和力增加（高达400倍），可能反映了TCR和pHLA之间高度复杂和动态的界面，仅使用模拟很难完全解开。事实上，亲和力增强的TCR与其亲本野生型TCR相比的分子动力学模拟分析强调，序列的变化不一定增加新的接触，但具有互补、间接或潜在的稳定作用。

表1. 概述使用噬菌体（M13丝状）、酵母（酿酒酵母）和哺乳动物细胞的亲和力增强展示系统的比较。负责修饰的线状底物和E3连接酶

定向进化使用哺乳动物细胞、酵母或噬菌体上展示的大型、完全或半随机TCR库进行亲和力选择，通常使用可溶性靶标pHLA分子。通常，需要几轮选择才能达到序列收敛和突变的选择以进行进一步分析。已经开发出使用TCR阴性T细胞系或其他常见哺乳动物细胞系进行TCR亲和力增强的哺乳动物展示方法，允许在亲和力增强和蛋白质生产/放大阶段使用来自同一物种的细胞。然而，由于细胞培养的限制，使用瞬时转染的哺乳动物展示方法的文库大小有限（~10^5–10^6），可能解释了迄今为止已经实现的相对适度的亲和力改进（~15倍）。此外，每个细胞引入多个转录本可导致基因型-表型链接的丧失和细胞表面异质性TCRs的显示。尽管逆转录病毒哺乳动物系统使用CRISPR/Cas9将TCR基因整合到单个基因组位点中的最新发展，实现了稳定的表达和转录正常化，克服了瞬时转染的一些问题，但非哺乳动物显示方法目前已被更好地用于产生亲和力增强的TCR。

酵母显示方法在单链形式中显示出特别的前景，这些单链形式已被用于产生具有低纳摩尔亲和力的TCR，并且具有关键优势，即酵母表面上的稳定显示往往与可溶性TCR的稳定性相关。然而，酵母展示文库通常为中等大小（~10^9–10^10），限制了选择的多样性，并且异源二聚体VαCα /VβCβ TCRs的显示存在问题，可能是由于错误折叠事件和TCR固有的不稳定性。相比之下，噬菌体展示技术具有较大的潜在文库尺寸（~10^12–10^13）、稳定的基因型-表型联系和成本效益，可以说是产生临床可翻译可溶性TCR的最成功方法。此外，异源二聚体VαCα/VβCβ TCR可以在噬菌体颗粒上高效表达。噬菌体展示使用CDR步行文库设计，一次靶向多达6个序列氨基酸位置与简并结合产生的突变，已经成功地将TCRs的亲和力显着增加到低皮摩尔-高飞摩尔范围。然而，噬菌体展示仍然有其局限性。例如，随机化多个残基的组合效应很快导致巨大文库大小难以管理（例如，在TCR中仅12个位置测试所有替代氨基酸组合将产生超过10^13个的文库大小，已经是10 ^11最大实用噬菌体文库的100倍）。这可以通过只靶向CDR环中的中心残基或使用多个单独的库来克服。

结构导向的蛋白质展示

由于在一轮亲和力增强中可以变化的残基数量有限，因此可以使用提供TCR-pHLA界面的更多分子细节的三级复杂结构信息来选择要包含在文库中以增强亲和力或选择性的残基。例如，基于特定晶体学数据的文库提供了在TCR-pHLA界面处固定关键残基的潜力，并允许CDR环中的侧翼残基随机化，以及根据pHLA表面上靶点的化学性质影响所选TCR残基的编码方案的选择。此外，结构导向的文库也可用于最大化TCR与多个肽侧链的相互作用，因为这种结合模式与更大的肽选择性相关。因此，晶体结构数据可以为设计更有可能增加与代表性不足的肽残基（就TCR接触而言）的相互作用的库提供关键信息，以在多个肽残基上更广泛地“分配”TCR结合能并提高特异性。结构信息还具有识别结构中近端氨基酸的潜力，但不一定是线性序列。这些残基可以在同一文库中组合，以减少不太可能产生亲和力增益的残基的突变，从而允许在所得的克隆中产生有益的协方差效应。由于结合模式的不同，晶体结构还可能揭示特定的CDR环对pHLA结合界面没有贡献。因此，结构引导方法可用于向环中添加残基并使用展示方法随机化，扩展特定环路以产生新的接触，并有可能增加亲和力/特异性。

小结

随着TCR工程领域的成熟，结合理性工程和定向进化的最佳技术的战略为未来的工作提供了一个有希望的方向。使用计算或物理深度突变扫描可以识别关键残基，以优先进行组合筛选。这可能有助于减少从多个退化密码子的载体突变，这可能增加免疫原性或引入不利的特征，而不会有助于所选TCR的有利特性。随着结构信息的可用性增长为更大的资源，预计这种集成策略将成为TCR工程的规范。

工程TCR特异性

在胸腺选择的严格性之外增强TCR时，一个关键的考虑因素是对TCR交叉反应的影响。然而，当考虑T细胞表面表达的TCR与可溶性双特异性TCR分子相比时，区分交叉反应的阈值非常重要。对于前者，如果将TCR的结合亲和力修改为特定自身抗原的弱μM范围，则可能发生与非靶向抗原的交叉反应（已经有多次报道功能性TCR信号传导与TCR结合，其亲和力低至KD~1000μM） 。相反，对于可溶性双特异性TCR，阈值可能处于低nM范围（取决于靶标的密度、可溶性TCR的浓度和所采用的效应器功能），以达到靶细胞表面的功能相关受体占用水平。换句话说，只要靶抗原和任何脱靶抗原之间存在亲和窗口，就可以通过简单地改变可溶性TCR的浓度来调整交叉反应性。

使用抗CD3部分重定向T细胞激活的双特异性T细胞激活者的特异性的另一个有趣的考虑因素是，信号起始的调节和阈值是否与天然TCR-pHLA参与产生的信号不同。虽然这还没有得到完全的答案，但这是一个重要的问题，因为天然TCR由一个复杂而复杂的信号网络调节，该网络包括CD3信号传导复合物，共受体（例如CD8和CD4）以及共刺激（例如CD28）和共抑制分子（例如PD-1）。事实上，已经表明，与使用人工信号传导结构域的CAR相比，插入天然TCR-CD3信号传导复合物的T细胞融合构建体（TRuCs）对抗原更敏感，并且也更严格地调节。因此，基于抗CD3双特异性T细胞结合者启动T细胞信号传导机制的性质可能会影响靶标和脱靶TCR结合之间产生的信号，与天然TCR-pHLA相互作用相比，可能会改变治疗窗口。

在考虑可溶性双特异性TCR试剂的脱靶反应性时，重要的是要表征特异性谱的任何变化，包括新的潜在反应活性，并测试适当健康细胞系和关键组织的功能交叉反应性。由于脱靶反应性很可能是肽特异性的，因此在动物模型中进行体内测试非常具有挑战性，因为与人体组织相比，即使是HLA转基因小鼠也会呈现出独特的肽库。因此，检测/监测不需要的反应性的特异性体外检测是工程TCR用作治疗药物的关键方面，例如过继细胞治疗试验中报道的致命毒性。根据我们的经验，通常从具有良好特异性特征的野生型TCR开始是有利的。例如，已经证明，具有能量平衡的TCR与多个肽侧链的相互作用显示出更大的肽选择性，并且具有这些属性的野生型TCR通常会导致在亲和力工程过程中保存这些有利的结合特征。相比之下，与能量热点结合的TCR容易产生高水平的交叉反应，并且通常与自身反应性相关。因此，对目标pHLA复合物中的候选TCR进行结构分析对于该选择标准具有极大的信息量。最近的研究还探讨了使用结构导向方法合理地设计TCR以具有明确的特异性分布。事实上，通过改变TCR与新抗原的结合几何形状，可以使用定向进化方法将TCR的特异性从一种抗原改变为另一种抗原。还报告了通过计算设计微调亲和力增强TCR特异性的进一步尝试，其中破坏/去除与HLA表面接触的“阴性”突变或改善TCR的形状互补性和能量相容性的突变已被证明可以增强对给定肽的特异性。

小结

虽然工程TCR特异性作为一个实用概念才刚刚出现，但最近的报告已经证明了概念验证的可行性。有证据表明，限制TCR识别有限的肽的突变，无论是通过去除HLA接触以使TCR更加“以肽为中心”，还是通过优化与多个肽侧链的接触以创建更独特的结合界面，似乎都是有利的。最后，由于评估TCR交叉反应性的更复杂的方法（组合文库筛选、pHLA展示文库等）的发展，现在测试蛋白质工程修饰的影响以微调TCR特异性变得越来越容易。因此，在计算方法中，结合蛋白质显示和更复杂的交叉反应性筛选手段，很可能在未来继续成为开发基于TCR的疗法的重要工具。

非传统T细胞配体面临的蛋白质工程挑战

靶向经典HLA分子的一个关键限制是它们的多态性。因此，靶向这些分子的药物将始终具有一定程度的患者限制，具体取决于个体的遗传背景。然而，有几个非传统的HLA样分子是单态的，从而提供了泛群体疗法的可能性。这些包括（但不限于）HLA-E、MHC相关蛋白1（MR1）和分化簇1 a，b，c和d（CD1a，CD1b，CD1c或CD1d），所有这些都具有与经典HLA I类非常相似的整体结构。有趣的是，尽管它们的化学性质非常不同，与经典的TCR-pHLA相互作用相比，TCR被证明以相似的亲和力(在微摩尔范围内)和结合模式与这些配体相互作用。然而，这些非传统HLA样分子的治疗靶点存在主要的蛋白质工程挑战，包括它们作为可溶性蛋白质的稳定性、疾病特异性配体的鉴定以及如何设计具有增强亲和力和理想选择性的TCR。下面将讨论HLA-E、MR1和CD1家族的一些注意事项。

HLA-E是Ib类HLA，具有有限的多态性，由体内几乎所有有核细胞表达。HLA-E在细胞表面的表达通常依赖于HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-G分子的前导肽的结合，通常具有VMAPRTL（L / V / I）L序列。 新出现的证据表明，HLA-E也参与T细胞病原体监测，来自HIV、HBV和结核病的HLA-E限制性肽作为保护性T细胞介导的免疫的配体。鉴于其广泛的表达特征，有限的多态性和免疫原性能力，HLA-E是一种有吸引力的治疗靶点。然而，HLA-E靶向TCRs的一个主要蛋白质工程挑战是调整其特异性，使其不会与几乎所有有核细胞表面存在的前导肽发生交叉反应。此外，迄今为止鉴定出的一些致病性肽已被证明可以产生不稳定的HLA-E分子，这使得它们在TCR的选择和亲和力增强中的应用极具挑战性。因此，已经采用了多种方法来稳定pHLA-E，包括引入跨越结合槽的人工二硫键，或将肽与重链共价连接。这些方法是否被证明对靶向TCR分子的治疗性HLA-E的选择和工程有效还有待证实。

MR1也具有有限的多态性，并且几乎在体内的每个有核细胞上表达。然而，与HLA-E和经典的HLA I类不同，MR1已被证明具有小的化合物（图1），其中最好的特征是微生物衍生的5-（2-氧代亚丙基二氨基）-6-d-核质氨基尿嘧啶（5-OP-RU），这是核黄素途径中的短寿命衍生物。最近的证据表明，MR1还可以呈现其他小分子配体，包括药物，非微生物MR1配体，甚至未定义的肿瘤相关配体。因此，与HLA-E一样，MR1是一个非常有吸引力和令人兴奋的未来治疗靶点。靶向MR1的主要蛋白质工程挑战是鉴定与疾病相关的配体并将这些复合物生成为可溶性分子，用于选择和表征工程TCR。目前还不清楚MR1提出的小分子抗原的性质是否允许设计具有所需配体特异性的亲和力增强TCRs，由于MR1在人体组织中无处不在的表达，这将是极其重要的。

与HLA-E，MR1和经典的HLA I类分子不同，单态CD1分子呈现脂质抗原（图1），并且其组织表达更为有限。例如，CD1c仅在造血来源的细胞上表达，例如胸腺细胞和成熟的造血细胞（如B淋巴细胞和髓系/单核细胞抗原呈递细胞）。虽然这限制了它们作为许多疾病的靶标，但它们非常适合靶向组织特异性条件，其中限制表达可以限制其他健康组织中毒性的可能性。然而，由于配体的疏水性，以及脂质抗原在各种CD1分子的沟槽内深处结合的事实，分离、表征和重新折叠具有疾病选择性脂质的CD1分子具有挑战性，使它们难以交换和提取。此外，关于CD1复合物的TCR识别的性质仍然存在一个主要问题，特别是TCRs是否可以独立于脂质，与相关脂质家族或单一脂质结合。更好地了解这种结合模式对于设计具有所需/预期特异性的基于CD1的TCR试剂至关重要。

综上，本文讨论的TCR稳定方法可能可转移到靶向非传统HLA样分子的TCR。然而，将这些TCR设计为增强亲和力涉及许多蛋白质工程挑战，包括生成稳定的非传统HLA样分子，为工程TCR的亲和力选择提供与疾病相关的配体，以及确保这些工程TCR对预期目标的保真度的方法。结构引导的方法和从为经典pHLA I类分子生成特定亲和力增强的可溶性TCR的努力中获得的经验对于解决这些挑战可能非常有价值。

总结

TCR具有明显的治疗靶向潜力，通过其询问细胞蛋白质组学（通过HLA呈递）、代谢组学（通过MR1呈递）和脂质组学（通过CD1呈递）状态以检测异常或失调信号的自然能力。然而，由于其作为可溶性蛋白质的天然稳定性较差且亲和力相对较弱，其作为可溶性药物的用途有限。为了克服这个问题，已经开发了几项蛋白质工程工作，包括引入稳定可溶性TCR的突变，文库选择的开发以及计算机努力增加受体的亲和力。使用无偏展示方法和计算筛选对TCR进行更多定制的稳定，这凸显了进一步优化单个TCR的可开发性特性的潜力。虽然已经建立了许多技术来选择突变以增强TCR对目标pHLA的亲和力，但很明显，对控制TCR-pHLA特异性的分子规则以及结构导向方法的理解的进步为进一步优化为治疗应用开发的TCRs的亲和力和特异性提供了新的机会。最后，将这些工程方法应用于其他TCR配体将会很有趣，以期产生可绕过HLA限制的可溶性TCR疗法。

参考文献：

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