科学派 | (一) 靶向磷酸肌醇激酶在疾病治疗中的前景

2022年11月14日，来自美国匹兹堡大学的Gerald R. V. Hammond、加拿大维多利亚大学的John E. Burke和瑞士伯尔尼大学的Brooke M. Emerling在共同通讯，在Nature Reviews Drug Discovery上发表长文综述，详细介绍了磷酸肌醇激酶抑制剂的研究现状及前景。我们将分3期和大家分享综述全文。

细胞膜中的磷酸肌醇是无数膜信号事件的主要调节因子，在膜运输、代谢、生长、信号传递和自噬中起着核心作用，其代谢的改变是许多人类疾病的发生的基础。磷酸肌醇有7种不同的磷酸化形式，3种为单磷酸化 (PIP)，3种为双磷酸化 (PIP2)，1种为三磷酸化 (PIP3) (图1, 左)。

在不同的细胞类型中，这些磷酸肌醇分布各异，当细胞表面受体激活后或细胞受病原体感染后，其水平可以发生显著的变化。在哺乳动物中，共有19个不同的基因可以编码合成磷酸肌醇激酶，催化磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol, PI) 生成磷酸肌醇；多达35个基因编码磷酸肌醇磷酸酶，参与磷酸肌醇的降解。在本文中，我们将着重对磷酸肌醇激酶进行介绍，大致上，磷酸肌醇激酶可以被分为3个家族：一个家族包含所有的磷酸肌醇-3-激酶 (phosphoinositide-3-kinase, PI3K; 也被称为磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol-3-kinase))和III型PI4K，另一个家族包含PIP激酶，最后一个家族为II型PI4K (图1, 右)。

图1. 磷酸肌醇以及参与其合成的磷酸肌醇激酶

在所有的磷酸肌醇激酶中，许多是人类疾病的治疗靶点，包括癌症、病毒感染、神经退行性疾病、发育障碍、糖尿病和炎症性疾病。磷酸肌醇代谢的改变是疾病发生发展的基础，因此利用小分子调节激酶活性可以为治疗提供许多机会。目前已知几种发生在磷脂肌醇激酶中的突变，可能通过导致激酶的过度活化或失活促进疾病发生发展。而在寄生虫感染的治疗中，靶向磷酸肌醇激酶的药物也表现出了一定的治疗潜力。

在临床上，许多I类PI3K抑制剂已被批准用于几种癌症的治疗；利用靶向激酶PIKfyve的小分子抑制剂治疗癌症和病毒感染的临床试验也正在进行中；靶向疟原虫PI4K的抑制剂目前也正处于疟疾治疗的临床试验中。

01 激酶结构与调节

PIKfyve从酵母到人类都是保守的，是真核生物中唯一能催化磷脂酰肌-3-磷酸 (PI3P) 生成磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸 (PI(3,5)P2) 的蛋白。PIKfyve的底物PI3P由III类PI3K VPS34生成。此外，细胞中PI5P的主要来源也与PIKfyve密切相关，主要通过PI(3,5)P2的去磷酸化间接产生。PIKfyve复合物主要定位于内体膜，在内体/溶酶体中，PI(3,5)P2参与对离子通道活性的调节，在离子浓度的平衡中发挥重要的作用。此外，PIKfyve还是内吞通路的关键调节因子，在内体运输、细胞迁移和溶酶体功能发挥中扮演重要的角色。

在哺乳动物细胞中，PIKfyve由2098个氨基酸组成，含四个假定的结构域：与PI3P结合的FYVE结构域、介导与Vac14相互作用的CCT结构域、目前已有结构上不可见的CCR模块，以及与PI5P4K和PI4P5K具有序列同源性的激酶结构域 (图2)。除了脂质激酶活性外，PIKfyve还具有蛋白激酶活性，该活性受抑制性的自磷酸化调节。PIKfyve蛋白的缺失在哺乳动物具有胚胎致死性。

图2. PIKfyve-FIG4-VAC14复合物结构

PIKfyve复合物中的所有组分从酵母到人类都是保守的，由蛋白PIKfyve、支架蛋白VAC14 (由VAC14编码;也被称为ArPIKfyve) 和双脂蛋白磷酸酶FIG4(由FIG4编码;也称为SAC3)组成。动物模型以及临床存在的突变均揭示了PIKfyve复合体在中枢和外周神经系统中的关键作用。通过PIKfyve-FIG4-VAC14复合物催化PI(3,5)P2的生成对神经系统组织的正常发育和维持至关重要。

在PIKfyve复合物中，FIG4具备脂质磷酸酶活性，会导致PI(3,5)P2去磷酸化，但FIG4的缺失却会导致PI(3,5)P2水平的降低，提示FIG4在调节PIKfyve活性中起着关键作用。VAC14形成了一个同源五聚体，结合1个PIKfyve和1个FIG 4的单拷贝结合 (图2)。VAC14亚基在与FIG4结合时会发生构象变化，导致其对PIKfyve的亲和力发生改变。此外，FIG4通过使PIKfyve激酶结构域中自抑制磷酸化位点 (S2053) 去磷酸化而增强了PIKfyve的激酶活性。

02 PIKfyve的抑制剂

虽然由于缺乏PIKfyve激酶结构域的高分辨率结构在很大程度上限制了结构引导的药物设计，但目前也已经有许多种PIKfyve抑制剂问世，且第一代PIKfyve抑制剂已进入临床试验阶段。

与许多其他的磷酸肌醇激酶类似，最早发现的PIKfyve抑制剂与靶向I类PI3K的药物研发工作密切相关，这项工作使得ATP竞争性的化合物YM201636得到鉴定。YM201636对PIKfyve具有高效的抑制作用，且其对PKIfyve的选择性比对I类PI3K p110α高100倍。这种化合物会导致PI(3,5)P2水平显著降低，发挥了类似于小干扰RNA (siRNA) 敲除PIKfyve的作用。在化学性质上与其非常相似的MF4抑制剂对PIKfyve表现出相似的有效性，其对PIKfyve的选择性是PI3K p110α的10倍左右。虽然这些化合物有助于确定PIKfyve在多种细胞类型和组织中的作用，但由于它们对I类PI3K p110α的弱选择性，进一步的临床研发受到了阻碍。

小分子药物apilimod最初被认为在细胞因子IL-12和IL-23的产生中发挥抑制作用，但具体机制未知 (图3)。临床试验中，在利用apilimod治疗克罗恩病、类风湿关节炎和牛皮癣时，虽然效果有限，但通常耐受性良好。然而，由于这种药物缺乏明确的治疗靶点，对其疗效和毒性的评估受到了限制。后来的研究发现，apilimod也是一种高效和选择性的PIKfyve抑制剂，在癌症和病毒感染的临床试验中显示出治疗癌症和病毒感染的前景。

在筛选抗癌和抗炎化合物的过程中，研究者也发现了其他PIKfyve抑制剂。其中包括IL-12和IL-23生成的抑制剂APY0201，能够靶向PIKfyve复合物，作为一种有效的ATP竞争性抑制剂，对其他激酶、G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR) 仅发挥有限的影响。化合物MOMIPP最初被发现能够通过甲基化促进细胞凋亡，后来被进一步确定为靶向PIKfyve的、有效的ATP竞争性抑制剂，对PI5P4Kγ有弱抑制作用，而对任何其他脂激酶抑制作用有限。

ESK981 (最初命名为CEP-11981) 最初作为酪氨酸激酶抑制剂被发现 (图3)，随后完成了药代动力学和I期临床评估。然而，在对一组前列腺癌细胞进行的多酪氨酸激酶抑制剂筛选的过程中，研究者意外发现ESK981同时也是一种有效的PIKfyve抑制剂，该药物目前正用于前列腺癌的临床试验。

图3. 目前用于临床的PIKfyve抑制剂

03 PIKfyve抑制剂在神经退行性疾病中的作用

PI(3,5)P2磷酸酶/调节因子、MTMR2、MTMR5或MTMR13突变会导致严重的外周脱髓鞘神经病——4B型Charcot-Marie-Tooth病4B型 (CMT4B)。近期研究发现，在体外实验中，apilimod可以挽救相髓鞘外展的表型，并提高CMT4B1  (MTM2突变体) 小鼠模型的神经传导速度，提示通过PIKfyve抑制剂防止异常的PI(3,5)P2积累似乎是这些罕见疾病的一种有前途的治疗方法。

从更广泛的层面来看，细胞内蛋白质聚集物的积累是许多散发性的神经退行性疾病的共同特征，如阿尔茨海默症和额颞叶痴呆中的tau蛋白，以及帕金森病中的α-突触核蛋白，这些蛋白质聚集物导致神经元死亡的 (图4)。错误折叠的蛋白质就像朊病毒的“种子”，它们会侵入神经元内吞通路，破坏溶酶体的完整性，诱导内源性细胞蛋白的错误折叠，最终导致细胞死亡。最近的研究表明，PIKfyve在这些神经退行性“种子”的内吞运输中的发挥的作用使其有可能成为一个有前途的治疗靶点。

在体外培养的阿尔茨海默症模型海马神经元中，通过siRNA、YM201636或apilimod抑制PIKfyve都可以显著减少tau蛋白聚集的出现。在tau蛋白诱导的人体类器官的FTD模型中，PIKfyve的抑制也可使表型得到缓解。在这个系统中，PIKfyve本身并没有降低tau蛋白水平，而是通过减少离子型谷氨酸受体的内吞循环来减少细胞兴奋性中毒死亡。

在离体的帕金森模型中，PIKfyve的抑制同样有效，YM201636、apilimod和vacuolin-1都能阻断HEK293细胞中α-突触核蛋白“种子”的聚集。这些抑制剂并没有阻断α-突触核蛋白原纤维的内吞，而是阻断了其通往溶酶体的通路，此外，它们还减少了溶酶体损伤，从而抑制“种子”向细胞质的逃逸。

除了上述疾病外，PIKfyve也被认为是ALS的潜在靶点。ALS是由运动神经元的选择性损失引起的，虽然主要是散发性的，但约10%的ALS由C9ORF72内含子中GGGGCC异常扩增导致，为常染色体显性遗传。最近的证据表明，这种异常扩增会通过两种机制导致神经退行性改变：首先，由于重复序列非AUG起始的翻译，导致二肽的蓄积，引发神经毒性，这与其他神经退行性疾病中毒性蛋白的聚集类似；其次，C9ORF72蛋白表达降低减少了离子型谷氨酸受体 (iGluRs) 的内吞作用，导致运动神经元的兴奋性毒性。在患者来源的诱导型运动神经元培养模型中，这种兴奋性毒性死亡可以被apilimod、YM201636或PIKfyve的敲除抑制 (图4)。

图4.PIKfyve抑制在神经退行性疾病中的作用

那么，通过PIKfyve抑制降低PI(3,5)P2水平是否可以作为神经退行性疾病的一般治疗方法呢？如前所述，PIKfyve复合物 (PIKfyve - FIG4 - VAC14) 中的任何一个蛋白功能的丧失本身就会导致小鼠和人类的神经退行性表型，包括渐冻症 (ALS) 、外周神经病变 (Charcot-Marie-Tooth disease)，以及包括中枢神经元髓鞘减少在内的严重的神经病。因此，PIKfyve活性似乎对中枢和周围神经系统的稳态至关重要。由于PIKfyve的抑制，VAC14和FIG4突变小鼠的神经元细胞内出现广泛的空泡化，使人联想到朊病毒导致的海绵状脑病中观察到的神经元海绵样病变，而这一表型的出现并非巧合。近期研究发现，小鼠大脑或人类下丘脑神经元细胞在感染朊病毒后，PIKfyve表达减少；在死于散发性克雅氏病 (sCJD) 的患者的大脑中也观察到这一点。朊病毒诱导的内质网应激可能会导致两个关键的锌指酰基转移酶分布异常，而这两种酶通常与PIKfyve的酰基化和稳定相关，其缺乏会导致PIKfyve迅速降解，导致大脑神经元空泡化并最终导致个体死亡。

综上所述，PIKfyve一方面通过调控内吞维持正常神经元的稳态，另一方面在蛋白聚集体和兴奋性毒性驱动的神经元退行性改变中发挥作用，选择性的PIKfyve抑制剂或许能够通过调和这两方面功能之间的关系实现最大的治疗潜能。由于PIKfyve抑制剂所应用的神经退行性疾病都是在几年或几十年时间里逐渐形成的，因此PIKfyve抑制剂的安全性、耐受性和有效性可能在短期内并不能得到有效的评估。

04 PIKfyve抑制剂在病毒感染中的作用

许多病毒病原体通过内溶酶体途径进入细胞，在与宿主细胞表面受体相作用之后，病毒与宿主细胞发生膜融合，病毒释放到细胞质中。PIKfyve能够通过破坏内体运输从而抑制病毒进入宿主细胞的胞质内，因而被视作抑制病毒感染的潜在靶点 (图5)。

图5. PIKfyve抑制剂在病毒感染和肿瘤中的作用

PIKfyve在病毒感染中的作用最初是通过对埃博拉病毒和马尔堡丝状病毒进行全基因组单倍体遗传筛选宿主因子时确定的。在筛选过程中，研究者发现了多个参与内溶酶体运输的成分，其中就包括PIKfyve，提示PIKfyve抑制剂可能能够抑制病毒进入宿主细胞所需的内溶酶体运输途径。Apilimod能够阻断埃博拉病毒和马尔堡病毒在肝脏、肾脏和单核细胞来源的巨噬细胞中的感染，通过阻断向NPC1阳性内体/溶酶体的运输，阻止病毒基因组释放到细胞质中。敲除PIKfyve复合物组分VAC14或FIG4也减少了丝状病毒的病毒进入，突出了PI(3,5)P2的产生在这些病毒进入细胞过程中的关键作用。在埃博拉病毒感染过程中，apilimod导致RAB5和RAB7内吞腔室膨胀成空泡，阻止病毒从内吞体腔室释放。

在COVID-19流行期间，许多研究者试图了解病毒进入细胞的机制，并开发相应的抑制剂作为抗病毒治疗药物。研究发现SARS-CoV-2通过内吞作用进入人体细胞，在病毒侵入稳定表达ACE2的HEK293细胞的过程中，PIKfyve发挥了关键作用。PIKfyve抑制剂apilimod或YM201636可显著抑制病毒对细胞的感染。在原发性人肺外植体模型中，apilimod也显示出了抗病毒效果。

尽管人们对使用PIKfyve抑制剂作为特异性抗病毒药物抱有极大热情，但目前仍存在潜在的障碍。譬如，PIKfyve在协调中性粒细胞的免疫反应中至关重要，是产生活性氧和细胞趋化性所必需的，PIKfyve使用的剂量需进一步明确，以确定其能在减少病毒感染的同时，不会显著降低免疫细胞的功能。

WX8家族的抑制剂为靶向PIKfyve治疗自噬依赖性癌症 (包括自噬依赖性黑色素瘤细胞瘤) 的策略提供了进一步的支持证据。WX8家族抑制剂可以破坏溶酶体稳态 (图5)，对自噬依赖性的癌细胞有选择性的杀伤作用，同时不影响非恶性细胞的增殖或活力。在多发性骨髓瘤  (MM) 的体外模型中，APY0201能有效抑制肿瘤细胞生长，而此前的研究表明MM细胞依赖自噬生存，通过抑制PIKfyve靶向自噬可能为MM患者提供了一种可行的治疗策略，然而，在肝癌中，情况恰恰与此相反， YM201636会通过促进自噬抑制肝癌生长。

在去势抵抗性前列腺癌临床前模型中，多酪氨酸激酶PIKfyve抑制剂ESK981可以阻止肿瘤生长。ESK981不仅能阻止自噬，还能将T细胞招募到肿瘤中。当免疫检查点抑制剂与ESK981联合使用时，肿瘤生长甚至能进一步被抑制。这些发现表明，通过ESK981靶向PIKfyve可能是一种有前景的免疫治疗手段，它能将前列腺肿瘤从非免疫原性的“冷”肿瘤转化为免疫炎性的“热”肿瘤。目前，单独使用ESK981或联合免疫疗法nivolumab治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的II期临床试验正在进行中，这些研究的结果将有助于我们更好地理解PIKfyve抑制剂在癌症治疗的疗效。

供稿 | 王彤彤

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

排版 | 可洲