孙超主任团队解读：胆汁酸转运蛋白基因的组蛋白乙酰化在肝硬化中起重要作用

2019年肝病领域顶刊JOH指出，世界范围内每年大约有200万例患者死于肝脏疾病，我国约有700万肝硬化患者，每年新发肝癌46万，乙丙肝感染者逾1亿，为社会带来沉重的医疗和经济负担。

为契合《“健康中国2030”规划纲要》中提出的将重大慢性疾病过早死亡率较2015年下降30%的目标，肝胆相照平台与天津医科大学总医院消化内科联合打造“肝研撷萃”精品栏目。

“肝研撷萃”由天津医科大学总医院孙超主任担任总编辑，范晓飞博士、惠洋洋博士、王晓雨博士、崔膑心博士任执行编辑，通过研读分享各种肝脏疾病诊断、治疗、预防和发病机制的前沿进展，结合团队自身的工作，为广大医生提供精进学术、助力临床的交流平台。

“肝研撷萃”第十九期，孙超主任团队对发表于Journal of Hepatology的一项研究进行分享，以启迪临床。

研究背景

肝纤维化的细胞机制是肝星状细胞(HSCs)转分化为肌成纤维细胞，合成细胞外基质(ECM)，导致纤维化带的形成。肝硬化主要由乙型和丙型肝炎病毒感染、长期大量饮酒引起，也可由遗传疾病或自身免疫性肝病引起，这些疾病可引起毛细胆管破裂，导致胆汁酸(BA)渗漏。BA稳态的破坏可能导致严重肝脏疾病的发生进展，但机制尚不清楚。

组蛋白乙酰化能够调控基因表达，在许多生物过程中发挥着重要作用。尽管目前仍未阐明这一重要表观遗传学修饰如何促进肝硬化的发展，但有报道其水平在人类肝硬化组织中增加。

实验结果

1. 肝细胞中MCRS1缺失会促进肝硬化

A：8周龄MCRS1(+/+)型肝炎和MCRS1(△/△)型肝炎小鼠肝脏的WB。

B-G：MCRS1(△/△)型肝炎和MCRS1(+/+)型肝炎小鼠相比，50%在8-15周龄死亡，病理改变明显，表现出严重的纤维化。

H：15周龄MCRS1(△/△)型肝炎和MCRS1(+/+)型肝炎小鼠相比，肝细胞纤维化标志物的相对mRNA水平升高。

I-K：MCRS1(△/△)型肝炎和MCRS1(+/+)型肝炎小鼠相比，ALT和血浆氨(NH3/NH4＋)水平明显升高，白蛋白下降。

L-M：E标本的CD31+(L)和SOX9+(M)的免疫组化定量，MCRS1(△/△)型小鼠血管生成增加，肝细胞受损，伴明显胆管反应。

2. 肝硬化中胆汁酸(BA)转运蛋白的表达失调

A-D：小鼠肝脏中相对BA相关蛋白水平的iTRAQ检测表，可以看到，NTCP是差异第二大的下调蛋白，Mcrs1(△/△)型肝炎小鼠的NTCP、OATP1B2、BSEP下调，MRP4上调。

E-F：BA的异常流动导致Mcrs1(△/△)肝小鼠血液和肝脏中总BAs的积累，包括一级BA(胆酸)。

G-H：BA转运体mRNA的相对水平，血浆、肝脏和肠道胆酸水平。肝细胞中hMCRS1过表达显著增加了NTCP(Slc10a1)水平。

I-P：NTCP过表达使BA水平正常化并防止肝脏纤维化，15周龄Mcrs1(△/△)型肝炎小鼠未检测到肝硬化。此外，90%过表达NTCP的Mcrs1(△/△)肝小鼠在15周龄以上存活，而超过50%的Mcrs1(△/△)肝小鼠在15周龄之前死亡。

总体来说，MCRS1丢失后，NTCP下调和BA流动异常与肝硬化发展有关。

3. FXR主要标记人造血干细胞和小鼠造血干细胞

A-D：从人类肝脏中进行的单核RNA测序中获得的细胞类型注释和选定的标记基因。圆点大小表示细胞的比例，颜色表示表达水平。可见NR1H4(FXR)主要在造血干细胞中表达。

E-H：从健康小鼠肝脏组织的单细胞RNA测序中获得的细胞类型注释和选定的标记基因。圆点大小表示细胞的比例，颜色表示表达水平。可见只有Nr1h4主要在造血干细胞中表达。

I-J：稳态小鼠不同组织成纤维细胞Nr1h4的RNA表达，以及疾病小鼠成纤维细胞Nr1h4的RNA表达。进一步的分析证实了Nr1h4在肝成纤维细胞中表达。

4. BAs激活造血干细胞中的FXR促进肝纤维化

A：Nr1h4HSC小鼠模型示意图。

B-E：分离的造血干细胞和肝脏切片证实了Nr1h4在造血干细胞中的特异性消融。

F：BDL手术方案示意图。

G-J：与Nr1h4(+/+)HSC组相比，Nr1h4(△/△)组BDL小鼠肝纤维化受到强烈抑制，Nr1h4(+/+)HSC小鼠离体肝细胞NTCP(Slc10a1)表达降低。

K：HepG2和HSC系LX-2细胞株体外实验示意图，用HepG2的培养液孵育LX-2。

L：MCRS1缺失的HepG2细胞的条件培养液中初级BAs水平高于对照组条件培养液，重新表达NTCP可降低条件培养液中BA的水平。

M-N：检测LX-2细胞中的纤维化标记物的相对mRNA水平。FXR缺失的LX-2细胞在MCRS1缺失的HepG2细胞的培养液中，纤维化标记物的表达低于siRNA处理的细胞；生长在MCRS1耗尽且过表达NTCP的条件培养基中，标记物表达显著降低。

O-Q：将Nr1h4HSC小鼠分离的造血干细胞用MCRS1型肝炎小鼠分离的肝细胞条件培养液进行培养，MCRS1(△/△)型肝炎小鼠过表达NTCP分离的肝细胞条件培养液可使Nr1h4HSC小鼠造血干细胞的Acta2和Col1a1纤维化标记消除。

5. MCRS1调控BA转运蛋白基因的组蛋白乙酰化

A-B：MCRS1中存在一个与Myb相关蛋白的DNA结合结构域非常相似的SANT。

C：在过表达HA-MCRS1WT和HA-MCRS1△130-192的HepG2细胞中进行IP实验，HA抗体和特异性MCRS1抗体的免疫沉淀分析表明，MCRS1与Histone H3 (HISH3)之间的相互作用需要SANT结构域。

D：可以看到，GST-MCRS1WT与HISH3之间相互作用，但与GST-MCRS1△130-192的相互作用明显减弱，表明HISH3通过SANT域直接与MCRS1结合。

E：MOF、KANSL3、PONTIN、REPTIN和HISH3与内源性MCRS1相互作用。

总体来说，这些数据表明MCRS1可能作为组蛋白乙酰化调控因子，以一种INO80/NSL独立的方式，将HDAC1锚定到HISH3上。

F：与过表达HA-MCRS1WT组相比，过表达HA-MCRS1△130-192细胞的核心组蛋白提取物中组蛋白乙酰化显著增加。

G：MCRS1缺失1周后，从MCRS1 (△/△)肝炎小鼠中分离的肝细胞显示组蛋白乙酰化显著增加。

H：在HepG2细胞中使用MCRS1抗体进行染色质免疫沉淀反应，结果显示MCRS1富集在BA转运基因的调控区域。

I-J：使用抗乙酰化H3K9和H3K18抗体在过表达HA-MCRS1WT和HA-MCRS1△130-192突变蛋白的HepG2细胞中进行的ChIP。实验表明，过表达HA-MCRS1△130-192的细胞在BA转运蛋白基因调控区显示组蛋白赖氨酸乙酰化增加。

K：在转染siCtr或siMCRS1的HepG2细胞中使用HDAC1抗体进行ChIP， MCRS1的敲除降低了HDAC1与BA转运蛋白基因的结合。

总  结

MCRS1是一个染色质修饰复合物的中心成分，通过调节肝细胞中的组蛋白乙酰化来控制BA转运蛋白基因的表达。组蛋白乙酰化介导的肝细胞NTCP下调是触发肝纤维化的主要事件，也是肝损伤和炎症的前期事件。NTCP的下调导致BA池的异常分布，肝窦内BAs积累通过激活HSCs中的FXR，促进肝纤维化。 

总之，MCRS1是一种组蛋白乙酰化调节因子，通过一个SANT域将HDAC1锚定到HISH3上，在适当调节基因表达和肝脏健康中发挥关键作用。肝细胞中MCRS1缺失通过增加BA转运蛋白基因的组蛋白赖氨酸乙酰化来诱导肝硬化。人类患者数据表明，这一机制可能适用于人类肝硬化，通过抑制组蛋白乙酰转移酶来靶向抑制肝硬化患者的组蛋白乙酰化可能是治疗这种致命疾病的一种可行选择。

主编点评

孙超主任

虽然随着类器官培养、器官芯片以及人工智能技术的快速发展，新药上市不需要在动物上进行试验也能获得美国FDA的批准。但基于传统动物模型的实验室研究仍然是阐明疾病发生机制、评估新药开发有效性和安全性的重要手段，因此建立能够最大限度模拟人类某种疾病特征的模型无疑成为了重中之重。肝硬化是一种全球范围内的常见疾病，位居死亡原因的第11位，更高居45-64岁人群常见死因的第3位，世界上约20亿人不同程度摄入酒精饮品，更有20亿人肥胖/超重、400万糖尿病患者存在罹患NAFLD的风险，这些都造成了肝硬化的发病率持续攀升。有鉴于此，依靠精准的动物模型，开展发病机制的深入研究，具备了愈加重要的临床意义和价值。而目前常用的四氯化碳、二甲基亚硝胺单因素造模方法不能准确捕获疾病进展过程中的病生理改变，给进一步的分子生物学机制阐明带来了困难。本期分享的文章有以下亮点：

1. 本研究利用了肝细胞特异性的MCRS1缺失小鼠遗传模型，成功模拟了人类肝硬化病情发展过程中出现的胆汁酸代谢紊乱，以及后续的肝星状细胞异常激活和纤维化进程。

2. 结合定量蛋白质组学、单核/单细胞RNA测序和染色质免疫共沉淀等技术，阐明了MCRS1缺失导致的表观遗传学调控异常(NTCP的组蛋白乙酰化修饰)能够诱导肝硬化的发生。

3. 来自人类肝硬化组织样本的差异基因表达数据分析也确证了MCRS1和NTCP水平与纤维化标志物密切相关。

展望：

有研究报道氨基酸可以作用于MCRS1进而调节溶酶体表面的mTORC1活性，而在肝硬化患者组织中观察到了明显的MCRS1从胞核向胞浆移位，推测营养因素可能驱动了MCRS1在不同亚细胞区室的差异表达，考虑到充足的临床证据支持支链氨基酸(BCAA)对肝硬化患者的显著治疗效果，那么能否通过富含BCAA的营养治疗，将MCRS1驱向特定基因的启动子序列，调控其表达而缓解病情，无疑是一种有趣而新颖的思路。

本文作者简介

杨婉婷

天津医科大学八年制临床医学专业，硕士研究生在读。以第一/共同第一作者身份在JPEN、Nutrition等杂志发表SCI文章5篇，目前研究方向为慢性肝病与营养不良、肌肉减少症和微量元素之间的关系。

专家简介

孙超

副主任医师，本科毕业于北京大学医学部，天津医科大学医学/理学博士，日本兵库医科大学研究员。全国疑难及重症肝病攻关协作组成员。主持完成国家自然科学基金一项。担任SCI期刊Journal of Clinical and Translational Hepatology编委、2021年度杰出编委，Gene Expression The Journal of Liver Research编委，任职Portal Hypertension & Cirrhosis首届学术委员会。2020年在EASL（欧洲肝脏研究学会）年会做口头发言，2021年在AASLD（美国肝病研究协会）年会做壁板展示。获得EASL的“Full Bursary”和APDW的“Travel Grant”奖励。以通讯作者在Clinical Nutrition, Liver International, Cell Death & Disease, Hepatology Communications等杂志发表SCI文章近60篇，他引720余次，h指数16，研究成果被ASGE（美国胃肠内镜学会）和EASL发布的临床实践指南引用。目前研究方向为调节性细胞死亡在急慢性肝损伤中的作用机制，体成分异常、营养不良、衰弱、睡眠障碍以及微量元素对肝硬化预后的影响及干预措施。

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