快报 | 利奈唑胺诱导耐多药结核病患者周围神经病变机制研究

作者：袁媛1，李金梦1，陈雁虹2，蔡青山1，徐颖颖1，林露婷3，郎雅珍1，郭苏杭1，张若英1，蔡鑫君1

作者单位：1浙江大学医学院附属杭州市胸科医院药学部；2浙江大学实验动物中心；3浙江中医科大学药学院

通信作者及单位：蔡鑫君，浙江大学医学院附属杭州市胸科医院药学部

Mechanism underlying linezolid-induced peripheral neuropathy in multidrug-resistant tuberculosis.

Yuan Y, Li J, Chen Y, Cai Q, Xu Y, Lin L, Lang Y, Guo S, Zhang R, Cai X.

Front Pharmacol，2022，13:946058.

doi: 10.3389/fphar.2022.946058.

PMID: 36160387.

研究背景

耐多药结核病（MDR-TB）仍然是主要的全球卫生问题，目前还没有全面的治疗干预措施。近年来，利奈唑胺已被广泛应用于MDR-TB的治疗，获得了良好的治疗效果。然而，利奈唑胺相关不良反应的报道随之增多，尤其是周围神经病变降低了患者的依从性。本研究探讨了利奈唑胺诱发MDR-TB周围神经病变的机制，提出自噬对周围神经损伤具有神经保护作用。在本研究中，我们收集了12份来自浙江大学医学院附属杭州市胸科医院MDR-TB患者问卷，其中10例患者出现疼痛。疼痛主要集中在足部，并伴有麻木。随后，我们用SD大鼠和施万细胞（Schwann，SCs）探讨其机制。结果发现，长期使用利奈唑胺的大鼠坐骨神经组织稀疏排列，并伴有相关的神经元、髓鞘损失和自噬结构蛋白（LC3B）表达下调。体外实验也证实了这一结果，表明利奈唑胺可抑制SCs的增殖。与对照组相比，p-AKT、P62蛋白表达升高，LC3B蛋白表达降低。此外，自噬抑制剂氯喹（CQ）也表现出与利奈唑胺类似的实验结果。综上所述，我们认为利奈唑胺诱导的周围神经病变与自噬通量的抑制有关。

研究方法

2021年9月至2021年12月，根据纳排标准从我院招募了12例MDR-TB患者，并通过问卷调查方式收集患者的疼痛类型、持续时间等关键临床信息。再采取体内外实验，通过BBB评分、行为轨迹分析、WB、免疫荧光、使用自噬抑制剂等方法验证利奈唑胺的作用机制。本实验收集的患者临床信息均经我院伦理委员会批准，在整个实验过程中严格遵循该方案。

研究结果

1. 临床调查问卷情况：我们确定10例患者出现了利奈唑胺引起的疼痛，主要表现为轻度疼痛 (图1B)。除疼痛感外，83.0%的患者出现麻木 (图1C)。此外，66.6%的患者报告利奈唑胺引起的疼痛主要发生在足部 (图1D)。

图1利奈唑胺致疼痛的类型及特点分析(12例)

A：纳入患者的性别比例。B：患者疼痛程度。C：疼痛类型分析及比例。D：疼痛的部位和比例

2.动物实验结果：研究发现，利奈唑胺不影响大鼠的行为能力(图2A-B)，但引起大鼠坐骨神经组织神经纤维和髓鞘排列稀疏(图3A-C)。通过免疫荧光染色，我们观察到利奈唑胺给药后坐骨神经LC3B的表达明显降低(图3D-E)，提示利奈唑胺有助于阻断自噬通量。为了更好地阐明自噬在利奈唑胺诱导的周围神经病变中的意义，我们选择SCs细胞进行后续实验研究。我们发现暴露于250μg/ml浓度72h时，SCs细胞伪足缩短，细胞形状呈圆形(图4D)。单克隆实验结果也证实，在该剂量下，SCs细胞的增殖能力明显降低(图4E-F)

图2利奈唑胺对大鼠行为和体质量的影响

A-B：各组大鼠体质量记录。C：各组BBB评分。D：每组大鼠4周时的行走足迹

图3利奈唑胺对大鼠坐骨神经的影响

A-C：抗mbp抗体(红色)和抗nf-200抗体(绿色)染色大鼠坐骨神经切片的代表性图像和定量分析(比例尺=10μm)。D-E：大鼠坐骨神经免疫荧光图像及分析。红色为抗lc3b抗体(比例尺分别为50μm和10μm)。* *：P＜0.01（与假手术组比较），***：P＜0.001（与假手术组比较）

图4利奈唑胺诱导SCs损伤的体外模拟

A-C：不同浓度利奈唑胺对SCs增殖的影响。D：光镜下SCs的形态(比例尺为100μm和50μm)。E和F：不同浓度利奈唑胺对SCs菌落形成能力的影响(比例尺=500μm)。*：P＜0.05（与假手术组比较），***：P＜0.001（与假手术组比较）

3.体外实验验证：结果显示，给予利奈唑胺后SCs细胞p-AKT的表达水平明显上调，而SCs的自噬途径被抑制(图5A-B)，为进一步阐明其作用机制，我们添加氯喹进行验证，检测自噬标记蛋白LC3A/B表达水平的变化。我们发现利奈唑胺和氯喹都可以降低LC3A/B的表达，同时使用利奈唑胺和氯喹可以更明显地抑制LC3A/B(图5E-F)。因此，研究表明利奈唑胺可能通过抑制自噬途径而抑制SCs的增殖。

图5利奈唑胺抑制自噬通量

A：利奈唑胺处理组SCs中p-AKT、p62和LC3A/B的蛋白表达。B：将p-AKT、p62和LC3A/B的强度归一化至GADPH。C：氯喹(40μM)和利奈唑胺暴露72h(比例尺=100μM)后SCs的形态特征。D：采用CCK8法检测不同组中SCs的增殖情况。E：加入氯喹和利奈唑胺72h后LC3A/B蛋白在SCs中的表达。F：LC3A/B强度归一化至GADPH。*：P＜0.05（与假手术组比较），**：P＜0.01（与假手术组比较）

研究结论

研究确定了利奈唑胺诱导的周围神经毒性，并证实利奈唑胺是通过阻断SCs自噬通量来实现的(图6)。这可能是干预利奈唑胺诱导的周围神经病变的一种潜在策略。

图6利奈唑胺诱导周围神经病变的机制图示

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供稿：袁媛

编辑：孟莉

审校：范永德

发布时间：2023-02-13

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