了解TCR亲和力、抗原特异性和交叉反应性，以改进TCR-T

使用T细胞受体（TCR）基因修饰的T细胞进行过继性细胞转移（ACT）是一个令人兴奋且迅速发展的领域。大量的临床前和临床研究表明，使用TCR工程改造的T细胞治疗癌症和病毒感染的可行性，安全性和有效性各不相同。尽管有证据表明它们的使用是有效的，但是在何种程度上以及如何改善这些疗法仍是研究的问题。由于TCR亲和力已被普遍接受为定义T细胞特异性和敏感性的主要作用，因此选择和生成高亲和力TCR仍然是设计更有效T细胞的基本方法。但是，通过随机诱变提高亲和力的传统方法可能会引起不良的交叉反应，从而导致on-target和off-target的不良事件，通过过度刺激产生耗尽的效应器，而忽略了已证明会影响抗原特异性的其他动力学和细胞参数。在本文中，对TCR基因修饰的T细胞的临床前和临床潜力进行了评论，总结了对TCR亲和力在抗原识别中所起的作用提出挑战的贡献，并探讨了结构引导设计如何用于操作抗原特异性和TCR交叉反应性，以提高用于ACT的TCR基因修饰T细胞的安全性和有效性。

TCR基因修饰T细胞的on-target和off-target交叉反应

使用T细胞受体(TCR)基因修饰的T细胞进行过继细胞转移(ACT)是一个令人兴奋且发展迅速的领域。它的使用促进了一种治疗癌症、病毒感染和其他免疫调节疾病的创新和有前景的方法。大量的临床前和临床研究已经证明了不同水平的可行性、安全性和有效性。尽管有证据表明，TCR基因修饰的T细胞是安全有效的，但如何最大限度地发挥其治疗潜力并将不良反应降至最低仍有待研究。

也就是说，T细胞识别正常组织上的靶抗原（on-target、off-target）或TCR交叉反应引起的相关或无关抗原的脱靶识别是最佳疗效和安全性的重要障碍（图1）。自最早的临床试验以来，这种不良事件就已经被记录，这表明靶抗原和TCR的选择是治疗设计中的关键考虑因素。例如，针对HLA-A2+/MART-1+黑色素瘤的早期临床试验表明，TCR基因修饰的T细胞通常是安全且耐受性良好的，具有一些临床益处；然而，后来的研究使用了更高亲和力的MART-1特异性TCR和高亲和力的鼠TCR靶向黑色素瘤抗原gp100，从而导致葡萄膜炎和听力损失，这是由于“on-target, off-tumor”破坏眼睛和内耳的正常黑色素细胞而引起的。一项针对黑色素瘤的临床试验使用酪氨酸酶特异性TCR显示没有严重的不良反应，但在一名完全缓解的患者中观察到了白癜风。此外，一项使用针对CEA+结肠癌的高亲和力CEA反应性TCR工程T细胞的临床试验提供了客观的临床反应，但也通过识别正常CEA+结肠癌组织诱导了炎症性结肠炎。

图1  TCR基因修饰的T细胞的on-target和off-target识别。尽管TCR基因修饰的T细胞被设计为重定向抗原反应并保持特异性，但临床前和临床数据表明，TCR工程T细胞具有以下潜力：(a)适当的“on-target, on-tumor”抗原识别(肿瘤根除)；(b) “on-target, off-tumor”识别(即正常组织上的低水平抗原)；或(c) off-target交叉反应(即靶组织或非靶组织上相关或无关的抗原)。更全面地了解TCR亲和力和其他物理和生物参数如何调节抗原识别，将使该领域更好地装备合理设计TCR，以最大化安全性和有效性。

可以说，更令人担忧的是不可预测的脱靶TCR与相关或无关抗原的交叉反应，这已在使用TCR基因修饰的T细胞的多项临床试验中得到证明。例如，两项针对癌症-睾丸抗原家族成员MAGE-A3的单独研究显示了相当大的脱靶毒性。其中一项试验使用了由CDR3区域进一步修饰的高亲和力TCR，定向突变导致了5/9名接受治疗的患者的临床退化，但导致了神经毒性，包括与相关抗原MAGE-A12的交叉反应导致2人死亡，此前未知的MAGE-A12在脑组织中表达。同样，使用亲和力增强的MAGE-A3特异性TCR的T细胞在单独试验中治疗的前两名患者中导致心源性休克和死亡。后来发现，在CDR2区域设计的亲和力增强突变产生了与肌动蛋白的交叉反应，肌动蛋白是一种在心肌细胞中表达的肌节蛋白，导致这些患者偏离靶点的心脏组织破坏。

虽然天然的高亲和力或亲和力增强的TCRs会导致一些不利的交叉反应，但交叉反应TCRs仍有潜在的好处，可以对抗以抗原突变为免疫逃逸驱动因素的癌症和病毒疾病的固有基因组不稳定性。因此，上述临床例子强调了解on-target和off-target识别潜力的重要性，并呼吁在设计用于ACT的工程T细胞的TCR时采取更谨慎的方法。

增强TCR安全性作为增强T细胞功能的工具

TCR和肽-主要组织相容性复合体(pMHC)之间的亲和力通常被认为在抗原识别中起着最核心的作用。因此，长期以来一直有人预测，高亲和力TCRs工程的T细胞比低亲和力TCRs工程的T细胞具有更好的效应。高亲和力的TCR不需要CD8共受体的存在来促进抗原识别，可以检测低水平的抗原，并且可以改造MHC-I限制的CD4+T细胞来提供辅助细胞因子支持，促进交叉启动，并促进肿瘤消退。然而，由于胸腺的选择，天然产生的高亲和力的CD8非依赖性TCR相对罕见，天然亲和力通常只发生在1-100μM之间。

因此，该领域的许多人诉诸于筛选高亲和力的TCR或增强先前表征的TCRs的亲和力，以提高TCR基因修饰的T细胞的疗效。此类策略包括给HLA转基因小鼠接种疫苗以产生高亲和力的鼠TCR，并使用高通量技术包括酵母和噬菌体展示来改变TCR的生物物理特性，增强TCR与nM或pM范围的亲和力。然而，有人担心鼠产生的TCR可以免疫原性诱导转移的TCR工程T细胞的清除，如使用小鼠来源的嵌合抗原受体T细胞。此外，用高亲和力TCRs设计的T细胞在遇到抗原时更有可能经历激活诱导的细胞死亡，并且已经被证明可以诱导前面讨论的on-target和off-target识别，这两者都对其治疗产生了反作用。此外，酵母和噬菌体展示策略依赖于随机突变，无法合理地调节特异性或交叉反应，盲目强调单个参数，并通过加强与MHC蛋白的相互作用而牺牲多肽来潜在地精确靶标毒性。

鉴于这些与高亲和力TCR相关的担忧以及创建它们所使用的策略，许多人仍然感到担忧。我们和其他人专注于了解TCR亲和力如何影响抗原识别和TCR交叉反应，区分TCR生化识别和T细胞功能识别，以更合理地设计基于TCR的免疫疗法。例如，我们利用多个定义良好的TCR模型来展示TCR的交叉反应潜力，了解亲和力和其他动力学参数和细胞参数是如何影响TCR交叉反应的，并提出结构指导设计可能提供一种合理而仔细地优化TCR工程T细胞的手段。

阐明TCR亲和力在抗原识别中的作用

如前所述，TCR-pMHC亲和力通常被认为是决定抗原识别的最关键因素。虽然支持证据是有效的，但在设计TCR基因修饰的T细胞时，重要的是进一步阐明TCR亲和力的作用，以决定对动力学或细胞参数的最适当操作。如果该领域能够更好地理解和定义TCR亲和力在抗原识别和TCR交叉反应中所起的作用，我们可能就能够更好地设计和实施更安全、更有效的基于TCR的免疫疗法。我们定义的TCR模型使我们能够评估决定基因修饰T细胞抗原识别的重要因素，并为评估TCR的交叉反应性和操作特异性提供了一个框架。

广泛发表的第一个系统是HCV1406 TCR，这是一种从A2克隆的HLA-A2限制性丙型肝炎病毒(HCV)反应性TCR-接受A2+供体肝同种异体移植的HCV感染者。我们验证了使用HCV1406 TCR基因修饰的T细胞作为HCV相关肝细胞癌（HCC）的潜在免疫治疗剂，显示TCR工程化外周血淋巴细胞（PBL）衍生的人T细胞的过继转移可以根除小鼠中HCV+HCC异种移植物。有趣的是，在其他HCV反应性TCR中发现HCV1406 TCR具有广泛的交叉反应性，识别各种天然存在的和流行病学上普遍存在的突变体逃逸变体HCV肽。发现自发消退HCV感染的患者中来自T细胞克隆的这些和其他TCR具有比发生慢性感染的患者更广泛的交叉反应性，将免疫适应性归因于具有交叉反应性TCR的T细胞并提出使用交叉反应性TCR可能对基因组不稳定的疾病有益，包括癌症和病毒感染。

鉴于我们可以产生具有明确抗原特异性的TCR基因修饰的PBL来源的T细胞，同时对一组相关的免疫逃逸抗原表现出交叉反应行为，我们测量了HCV1406 TCR与每个突变的免疫逃逸变异肽的亲和力，称为改变的多肽配体(APL)。我们表明，功能识别由细胞因子的释放和脱颗粒决定，并不仅仅由TCR-pMHC亲和力定义。值得注意的例子包括：在两个具有几乎相同的TCR-pMHC亲和力的APL中，只有一个被识别；具有不可检测到的TCR-pMHC结合的APL仍然被功能识别；细胞因子释放的程度或脱颗粒的百分比与TCR-pMHC亲和力的相对变化没有明显的相关性。后来，多功能分析证实了这一点，表明APL相互作用调节了功能表型的数量或多样性，但同样与TCR-pMHC亲和力没有直接关系。

我们评估了其他被认为影响抗原识别和交叉反应的参数，表明抗原密度和不同水平的TCR转基因表达对交叉反应有深远的影响，这并不总是与TCR-pMHC亲和力的差异相一致。我们还表明，CD8共受体对lck的募集和信号增强对于低亲和力相互作用也是关键的，但它在稳定TCR-pMHC结合方面的作用不是。这一观察证实了早先在其他TCR系统中的研究，这些研究试图确定CD8在抗原识别中所起的作用。我们还表明，对TCR的修饰可以增强链配对，限制与内源性TCR链的错配或者减少对CD3的竞争，从而减轻对CD8的依赖，增强交叉反应，并增加T细胞的多功能性。通过四聚体或TCRvβ抗体结合来评估，这些小的修饰也促进了低水平甚至无法检测到的转基因的抗原识别，证明了对生物学功能的深远影响。

将这些功能和动力学研究与结构方法相结合，解决了野生型TCR-pMHC相互作用的晶体结构，并使用计算建模来预测哪些TCR、肽或MHC基序或氨基酸残基可能促进交叉反应。值得注意的是，基于晶体结构的建模预测，HCV1406 TCR实现了微小的构象变化，以适应某些肽的变化。但是，先前已经提出，TCR-pMHC界面上的这种微小的构象变化可以显著改变TCR启动的信号事件和下游传播，这可能使显著不同的功能结果合理化，尽管结合亲和力相似。更引人注目的是，通过丙氨酸扫描，我们发现丙型肝炎病毒同源肽NS3：1406-1415的单个氨基酸残基是HCV1406 TCR结合的关键结合“热点”，以至于它取代了以前不被识别的HLA-A2限制的自身抗原酪氨酸酶诱导T细胞功能识别。

综上所述，这些数据表明TCR亲和力在抗原识别中并不是唯一的决定性作用，亲和力与其他动力学、细胞和结构参数结合可能协同影响抗原特异性和TCR交叉反应。这些数据还告诫不要使用随机突变来产生高亲和力的TCR，以此作为创建更有效的效应器的手段，并提示更合理的结构指导方法操作TCR-pMHC界面可能为工程特异性提供更好的工具。此外，对反应性的筛查必须是广泛的，不限于目标抗原或密切相关的同系物。虽然这些观察是重新评估TCR-pMHC亲和力在抗原识别中作用的重要第一步，我们承认它们描述了单个TCR的行为；然而，小组正在进行的评估其他特征良好的TCR的研究，包括HCV1073，TIL 1383I和DMF5 TCR表明这些观察并不是HCV1406 TCR独有的。

事实上，其他使用额外TCR的小组也支持我们的观察结果。例如，一项研究表明，五个与相同pMHC具有类似结合亲和力的TCRs对其他抗原表现出不同的交叉反应光谱，这是通过TCRs的不同结构界面和CDR3环动力学来合理化的[50]。它们表明，尽管亲和力相似，但结合的结构机制和氢键形成的程度分别控制着影响抗原特异性和交叉反应的相对水平的刚性或灵活性。其他人认为TCR亲和力和抗原敏感性之间的不一致是因为传统的使用三维(3D)中的可溶性TCR和pMHC来测量亲和力的方法不能准确地反映TCR-pMHC相互作用的生理规律。使用传统的3D方法也没有考虑分子运动的减少的空间自由度以及辅助受体的存在和贡献。事实上，比较2D和3D技术显示了截然不同的动力学参数，2D测量显示了与体外T细胞功能反应更好的相关性。有趣的是，一项使用自体黑色素瘤反应性TCR转导的T细胞的临床试验发现，尽管3D亲和力测量相同，但临床或生物学反应与肿瘤负担减轻或发展为白癜风(on-target, off-tumor)的患者接受的工程化T细胞显示出比无反应者更高的2D亲和力。其他人提出了替代的结合参数，包括TCR-pMHC结合过程中表现出的力和连续触发的量和速率，也可以提供更好地评估抗原敏感性或预测生物功能的参数。在设计和评估ACT中使用的TCR时，进一步评估和调整这些参数可能是有益的。

为结构导向的TCR设计提供案例

很明显，不同的物理和细胞参数可以显著调节抗原特异性和TCR交叉反应。对此，我们和其他人提出了一种更合理的、结构导向的TCR设计，使用对TCR-pMHC相互作用的结构形貌的精细操作，而不是大的亲和力增量，这可能为TCR设计提供一种更可预测和更安全的方法。如上所述，随机突变对TCR亲和力的增强可能不加选择地通过改善TCR与MHC蛋白之间的相互作用而牺牲多肽，导致脱靶交叉反应。受过更多学习的策略，了解TCR如何结合其抗原，而不仅仅是更紧密地结合多肽/MHC复合体，可能会更好地预测和避免on-target和off-target效应。

基于我们对HCV1406 TCR的观察，我们检查了临床相关的DMF5 TCR，强调了TCR交叉反应的意想不到的结合机制，并使用新的结构指导方法来操作抗原特异性。DMF5 TCR最初被鉴定为针对受HLA-A2限制的MART-1黑色素瘤抗原，并用于临床试验，但后来通过酵母展示多肽-MHC文库，意外地发现它与两类具有相反中心核心的不同类型的多肽结合(一种疏水，一种以带电氨基酸为主)。我们发现，DMF5 TCR的交叉反应不是小的TCR构象适应性(类似于HCV1406 TCR)，而是多肽、HLA-A2和TCR侧链重排的戏剧性变化。DMF5 TCR不是对MART-1/HLA-A2复合体的分子模拟，而是出人意料地容纳了新的pMHC表面，展示了TCR交叉反应的新原理，并强调了与预测TCR工程T细胞反应相关的挑战。

我们利用DMF5 TCR的交叉反应性来评估一种新的结构指导方法来调节TCR的特异性。结构导向的计算设计既包括增强以多肽为中心的结合的“正向设计”，也包括削弱与MHC相互作用的“负向设计”。虽然阳性设计突变导致结合亲和力的逐步提高，但它们也引入了新的交叉反应并削弱了T细胞的效力。然而，结合了阳性和阴性设计的DMF5变体保持了对MART-1的有效识别，消除了与更不同类别的表位的交叉反应，并减少了与许多其他MART-1同系物的交叉反应。

虽然该系统测试了有限数量的实验和计算结构导向筛选，并不评估DMF5 TCR的所有已知生理靶点，但这些观察结果为使用结构导向设计来提高抗原特异性，同时将TCR交叉反应降至最低提供了原则证据。在这些基础观察的基础上，进一步的努力正在进行中，以完善计算设计，评估更多的多肽靶标，并评估对T细胞多功能性的影响。

未来展望

高亲和力TCR基因修饰的T细胞的治疗前景因多项临床试验中记录的on-target和off-target不良事件而受到抑制。更好地了解支配抗原特异性和TCR交叉反应的基本原理对于优化这些免疫疗法是必要的。我们和其他人最近确定了一些生物和物理参数，如表1所示，这些参数调节抗原特异性和TCR交叉反应。我们的观察结果，在这篇聚焦的研究综述中讨论，建立了一个新的工作模型，突出了以前未被认识到的动力学、细胞和结构参数之间的复杂关系，这些参数控制抗原识别和T细胞功能，在设计ACT的TCR时应该考虑到这些关系（图2）。

表1 影响TCR-pMHC参与和T细胞多功能反应的因素

图2  控制TCR特异性和导致功能性T细胞反应的交叉反应的物理和生物参数模型。设计基于TCR的免疫治疗时，该领域应该考虑以下之间的相互作用，而不是TCR亲和力决定抗原识别和确定基因工程的候选TCR，(a)生物物理参数：2D和3D结合亲和力、开/关速率、施加在TCR-pMHC复合体上的力的大小和持续时间；(b)配体密度；(c)TCR密度；以及(d)TCR、CD3和辅助受体的连续触发或信号传播。这些因素共同在促进(a-d)生化TCR识别为(e)功能性T细胞反应中发挥协同作用

考虑到这些观察结果，应该实施使用更有学习的TCR设计和体内交叉反应性的综合预测分析的方法，以产生更有效和更安全的效应物。建议应谨慎使用仅设计用于以随机或盲法方式增强TCR亲和力的努力，例如酵母和噬菌体展示。相反，TCR-pMHC界面的合理结构引导调节可以更好地生产性和可预测地调节抗原特异性和TCR交叉反应性。一些策略依赖于使用具有高保真预测建模的计算设计来选择靶向突变以预测构象变化，随后表征结合参数和结构以重新形成和改善算法性能。其他人使用已知的TCR-pMHC结构合理设计TCR和pMHC之间接触区域的序列取代，以改善表面形状，能量互补性和T细胞效力。TCR-pMHC相互作用的深度突变扫描采样了多个位置上每个氨基酸改变的影响。结合计算机结合分析，这提供了比传统酵母和噬菌体展示技术更明智的工程TCR高通量筛选。

除了更了解TCR工程，交叉反应测量的使用可能更好地筛选或预测高亲和力TCR在体内使用之前对on-target或off-target抗原的识别。一些公司实施了新颖的体外特异性筛选，或称“X-扫描”，以调查TCR与表位的交叉反应，其中靶肽的每个残基都突变为所有可能的氨基酸。这使得与丙氨酸扫描相比，可以更敏感和更具体地预测耐受残留物，并更好地评估与同源抗原具有类似亲和力的TCR之间的交叉反应差异。然而，这一战略仅限于单一残基替换，没有考虑到仍可识别的更广泛的共同基序相似性。其他人则产生了被称为“velcros”的低亲和力的从头合成多肽，作为一种工具来广泛探索工程TCR的特异性，并预测混杂的多肽识别。此外，许多人已经将重点转移到多肽靶点选择上，以此作为调节或预测TCR特异性的一种手段。特别是，一项研究表明，即使将具有类似结合参数的TCR与任何一种pMHC复合体进行比较，多肽与MHC的结合亲和力在决定T细胞的整体效力和特异性方面发挥着关键作用。识别或操纵某些肽-MHC结合参数可能提供额外的工具，以更好地为靶标选择提供信息，并预测意外的TCR-pMHC相互作用。

总体而言，这些新策略的未来对于预测和定制给定TCR系统中的抗原识别具有重要意义。随着更多地了解影响抗原识别的参数，解锁TCR-pMHC的结构和生物物理界面，以及改进预测和调节抗原特异性的技术，可能能够极大地提高TCR基因修饰的T细胞的安全性和有效性。这可能会进一步增强研究和操纵其他免疫细胞和受体类型、接近表位发现和评估疫苗设计的方式。

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