细胞转染之稳定细胞株的构建

细胞转染,简而言之，就是将外源分子（如DNA,RNA等）导入真核细胞中的一种技术。

分类：

瞬时转染（transient gene expression, TGE）和稳定转染(stable gene expression，SGE)两种。

瞬时转染

指外源 DNA或RNA 转入宿主细胞后不整合到宿主染色体中进行外源目的基因的表达。

特点：

1.目的基因未整合到染色体上，超螺旋质粒DNA有较高的转染效率；

2.转染24h-72h后常需要用到一些报告系统如荧光蛋白、β半乳糖苷酶等来帮助检测；

3.表达持续时间48-72h,随细胞分裂而稀释直至丢失；

4.用于快速分析:如基因产物短期表达、蛋白质小规模表达纯化。

稳定转染

指外源DNA转入宿主细胞后将外源目的基因整合到宿主染色体中进行表达。

特点：

1.目的基因整合到染色体上，需要使用线性DNA（线性DNA虽然比超螺旋状的DNA转入量低，但整合率高）；2.外源DNA整合到宿主细胞染色体中大约为1%，通常需要通过一些选择性标记反复筛选，才能得到稳定转染的同源细胞系。3.随宿主细胞基因组复制、转录、翻译，并被稳定遗传；4.用于获得稳定表达的外源基因的单细胞克隆：如大规模蛋白质的合成，长期的药理学研究遗传机制的研究等。

图1 细胞转染流程图

细胞转染的方法

物理法：电穿孔法、显微注射法和基因枪法；

化学法：磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、多种阳离子物质介导；

生物法：病毒介导转染、逆转录病毒、腺病毒。

一些转染方法方法的比较

图2 细胞转染的一些常见方法

稳定细胞株：一般是将外源DNA克隆到具有某种抗性或者选择基因的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到染色体中，用载体中所含的选择标志进行筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白的细胞株。

1. 基因过表达、突变、沉默等科研用稳转细胞株构建；

2. 重组抗体，细胞因子等生物药的稳转细胞系前期筛选。

技术流程及周期

1. 重组表达质粒构建（1周）

2. 药物本底浓度测定（2周，可与1同时进行）

3. 细胞转染（1天）

4. 多克隆稳定细胞株筛选及鉴定（2-3周）

5. 单克隆稳定细胞株筛选及鉴定（3-4周）

6. 稳转细胞株产量、活性检测及稳定性研究（根据客户需求）

图3 技术流程图

高质：外源基因严格鉴定，细胞来源清晰，无污染

高产：重组蛋白/抗体表达量可快速优化至2g/L以上稳定表达

稳定：独有的GS稳转系列载体配合MSX药物筛选，实现稳定传代15代以上

快速：筛选高产细胞株，周期短至3个月

灵活定制：可针对重组蛋白/抗体全长或片段进行个性化表达

经验丰富：专业的技术团队，已成功为国内外多家医药公司和研究单位构建交付稳定细胞株

多筛选系统：G418/潮霉素/嘌呤霉素筛选系统，GS/DHFR 筛选孵化系统等

案例

稳转优化前表达量28mg/L；稳转优化后表达量2.3 g/L

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