快报 | 巨噬细胞靶向纳米材料介导结核病的光动力联合免疫治疗

作者：田娜，段惠娟，曹廷明，戴广明，盛钢，褚洪迁，孙照刚

第一作者及单位：田娜，首都医科大学附属北京胸科医院/北京结核病胸部肿瘤研究所

通信作者及单位：孙照刚，首都医科大学附属北京胸科医院/北京结核病胸部肿瘤研究所；褚洪迁，首都医科大学附属北京胸科医院/北京结核病胸部肿瘤研究所

Macrophage-targeted nanoparticles mediate synergistic photodynamic therapy and immunotherapy of tuberculosis

Na Tian，Huijuan Duan，Tingming Cao， Guangming Dai，Gang Sheng， Hongqian Chu，Zhaogang Sun.

RSC Adv，2023，13（3）：:1727-1737.

doi：10.1039/d2ra06334d

研究背景

CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）是人工合成的单链DNA分子，可作为免疫佐剂或单独作为免疫治疗剂，通过刺激巨噬细胞等细胞内的Toll样受体（TLRs）诱发Th1型免疫反应。然而，由于CpG ODNs带负电荷，容易被核酸酶降解，很难穿过细胞膜。此外，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）主要存在于巨噬细胞中，因此需要使用具有巨噬细胞靶向性的纳米材料递送CpG ODNs，以改善细胞对CpG ODNs的摄取，以达到最佳治疗效果。

研究方法

1.纳米材料的制备：首先构建被用作光敏剂和递送CpG ODNs的载体PCN 224，然后，用PCN 224负载CpG ODNs得到PCN-CpG。最后将巨噬细胞靶向分子磷脂酰丝氨酸PS包裹于PCN-CpG表面，得到靶向巨噬细胞的联合光动力治疗与免疫治疗的复合纳米材料PCN-CpG@PS。

2.纳米材料的表征：对合成的PCN-CpG@PS纳米材料进行X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）、动态光散射（DLS）、Zeta电位、紫外可见吸收光谱及荧光发射光谱表征。

3.纳米材料的体外生物安全性、靶向性、ROS产生能力及抗结核效果的评估：以RAW264.7巨噬细胞为模型，评估纳米材料的体外细胞毒性、巨噬细胞靶向性、经近红外光照射后在细胞内产生ROS的能力。使用H37Rv菌株感染RAW264.7细胞，评估纳米材料的体外抗结核能力。

4.纳米材料的体内靶向性、免疫应答及抗结核效果的评估：对健康6~8周龄BALB/c小鼠进行分组处理，并用小动物成像仪检测纳米材料在其体内的分布情况。其余6～8周龄BALB/c小鼠以气溶胶方式感染BCG，感染10天后的第1，5，8天分别对小鼠进行如下分组处理：（1）PBS；（2）PCN；（3）PCN-CpG；（4）PCN-CpG@PS；（5）CpG；（6）PBS+NIR；（7）PCN+NIR；（8）PCN-CpG+NIR；（9）PCN-CpG@PS+NIR。治疗后5天处死解剖小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾等脏器，计数小鼠右肺CFU，其余脏器制备切片并进行HE及免疫组化染色。

研究结果

1.纳米材料的表征：PCN-CpG@PS纳米材料的合成过程如图1a所示。XRD结果显示所制备的PCN 224晶体结构与理论上模拟的晶体结构相符，而且结晶化较好（图1b）。通过扫描电子显微镜（SEM）观察，PCN、PCN-CpG以及PCN-CpG@PS均显示出均匀的球状结构（图1c，d和e）。动态光散射（DLS）分析显示三种纳米材料的直径分别为（159±2.27） nm，（224±3.78） nm和（163±5.19） nm（图1f和g），Zeta电位分别为+26.7 mV，-24.4 mV和-29.6 mV（图h），表明CpG及PS的成功负载及修饰。

图1

PCN-CpG@PS的制备和表征。(a) PCN-CpG@PS复合纳米材料的合成示意图；(b) PCN-224的X射线衍射（XRD）图；(c-e) (c) PCN-224(d) PCN-CpG和(e) PCN-CpG@PS的扫描电子显微镜（SEM）图；(f) PCN-224, PCN-CpG, PCN-CpG@PS的粒径分布图和(g)相应的定量平均尺寸分析；(h) PCN-224, PCN-CpG, PCN-CpG@PS的Zeta电位图

2．纳米材料的体外细胞毒性评估：CCK8实验结果表明在黑暗条件下，PCN，PCN-CpG及PCN-CpG@PS的浓度在 1~10 μg/ml范围内对RAW 264.7细胞没有产生明显的细胞毒性，生物相容性较好。

图2

黑暗条件下PCN，PCN-CpG及PCN-CpG@PS对RAW264.7细胞的毒性

3．纳米材料的体外靶向性评估：通过共聚焦成像和流式细胞术评估CpG 2395、PCN-CpG和PCNCpG@PS的巨噬细胞靶向性。流式细胞仪分析和共聚焦（CLSM）图像都显示相较于其他组，PCN-CpG@PS对RAW264.7细胞有良好的细胞摄取。这表明在PCN和PS的帮助下，RAW264.7细胞摄取了更多的CpG 2395。

图3

（a）RAW264.7细胞分别用PBS，CpG 2395，PCN-CpG及PCN-CpG@PS处理4h后的共聚焦图像（CLSM）；（b）相应的流式细胞分析结果；（c）相应的平均荧光强度（MFI）定量分析

4．纳米材料的体外ROS产生能力评估：通过共聚焦成像和流式细胞术评估了PCN、PCN-CpG和PCN-CpG@PS在640nm激光照射下在RAW264.7细胞内产生活性氧（ROS）的水平。PCN-CpG@PS处理组的细胞内显示出最高的荧光强度，相比于其他组ROS含量显著增加，提示PCN-CpG@PS可以显著提高RAW264.7细胞内ROS水平。

图4

在640nm激光照射下复合纳米材料的ROS生成水平。(a) 用PCN、PCN+NIR、PCN-CpG+NIR和PCNCpG@PS+NIR处理的RAW264.7细胞的共聚焦图像，(b)相应的流式细胞仪分析结果和(c)相应的平均荧光强度（MFI）定量分析

5．纳米材料的体外抗结核效果评估：在体外用不同的复合纳米材料处理感染H37Rv感染的RAW264.7细胞。处理后第3天计数CFU。据统计，与对照组（6.097±0.072）相比，PCN + NIR及PCN-CpG@PS处理组平板菌落数量减少（P＜0.0001）。PCN-CpG + NIR处理组的CFUs进一步减少（4.963±0.071）。表明与单独的光动力或免疫治疗相比，光动力联合免疫治疗进一步抑制了细胞内MTB的生长。此外，PCN-CpG@PS+NIR处理组平板菌落数量最少（4.460±0.151），抗菌效果最好，表明PCN-CpG@PS辅以近红外光照射具有良好的抗结核活性。

图5

PCN-224、CpG、PCN-CpG和PCN-CpG@PS的体外抗菌效果

6．纳米材料的体内分布：本研究将CpG 2395、PCN-CpG和PCN-CpG@PS分别经尾静脉注射到小鼠体内6 h后，处死小鼠并取其主要脏器，采用小动物成像仪进行成像（图6）。结果显示与游离CpG 2395和PCN-CpG处理组相比，PCN-CpG@PS处理组在巨噬细胞丰富的肝、脾、肺、肾等器官显示出更明显的荧光分布，表明PCN-CpG@PS可在体循环中靶向蓄积于巨噬细胞中，提高结核分枝杆菌感染部位的材料浓度，从而提高治疗效果。

图6

小鼠尾静脉注射CpG 2395, PCN-CpG和PCN-CpG@PS后6小时主要器官的荧光图像

7．纳米材料的体内免疫应答：对小鼠肺组织切片中TNF-α和IFN-γ两种细胞因子进行免疫荧光染色，评估PCN-CpG@PS的体内免疫刺激活性。如图7所示，与其他组相比，PCN-CpG@PS + NIR处理组的TNF-α和IFN-γ分泌水平最高。表明PCN-CpG@PS辅以近红外光照射促进了TNF-α和IFN-γ细胞因子的分泌，增强了机体免疫应答能力。

图7

激光照射下不同处理组的BALB/c小鼠肺部切片的TNF-α和IFN-γ（a & c）免疫荧光染色和相应荧光强度值（b & d）

8．纳米材料的体内抗结核效果评估：在体内，PCN-CpG@PS + NIR处理组的抗结核效果最好，与体外抗结核实验结果一致。然而，在体内，PCN-224+NIR组的CFUs与PCN-CPG-NIR组没有明显差异，考虑是体内多种细胞参与免疫反应的结果。

表1 小鼠感染BCG模型经不同处理后的肺部CFUs（Mean±SD）

注  a ：P< 0.0001； b：P < 0.05.；c：P < 0.0001；d ：P < 0.05

研究结论

PCN-CpG@PS可以结合光动力治疗、免疫治疗以及靶向治疗的优势，起到良好的协同抗结核效果。

注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点

供稿：田    娜

编辑：于    菲

审校：范永德

发布日期：2023-02-10

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