2bRAD-M揭示单侧肾结石患者肾盂泌尿系

背景： 肾结石病 (KSD) 的发病机制尚不完全清楚，潜在的促成因素仍有待探索。几项研究表明，使用 16S rRNA 基因测序，结石形成者的尿液微生物组（urobiome）不同于健康个体的尿液微生物组，其中大多数仅提供属水平的微生物鉴定。微生物组 2bRAD 测序 (2bRAD-M) 是一种新型测序技术，能够以物种分辨率准确表征低生物量微生物组。我们的目的是应用 2bRAD-M 来分析单侧肾结石患者的肾盂尿路生物组，并比较有结石和无结石的尿路生物组。

方法： 共纳入30例单侧肾结石患者，采集其双侧肾盂尿液。将输尿管镜插入装有结石的肾盂，将输尿管导管置入输尿管镜，收集肾盂尿液。使用新设备再次重复此过程以收集另一侧的尿液。进行2bRAD-M表征单侧结石形成者的肾盂尿路生物组，以探讨结石侧和非结石侧之间是否存在微生物差异。

结果： 结石侧微生物群落组成与非结石侧相似。配对比较显示结石侧棒状杆菌增多，普氏菌和乳酸杆菌减少。四种物种（Prevotella bivia、Lactobacillus iners、Corynebacterium aurimucosum 和 Pseudomonas sp_286）在非结石侧的数量过多。通过线性判别分析效应大小 (LEfSe)，还确定了两组之间的 24 个差异类群。在相关分析中观察到属和种之间广泛而密切的联系。此外，利用特定的富集物种构建了一个随机森林分类器，可以以 71.2% 的准确率区分石方和非石方。

结论： 这项首次 2bRAD-M 微生物组调查为尿液生态失调在 KSD 中的潜在作用提供了重要提示，并提供了对结石形成机制的更好理解。

图1肾盂尿液收集的图形表示。

将输尿管镜轻轻插入结石侧肾盂，输尿管镜置入输尿管导管收集肾盂尿液。然后，使用新的输尿管镜和新的输尿管导管重复此过程以收集同一患者非结石侧的肾盂尿液

图 2结石组与对照组之间肾盂尿路微生物群的微生物多样性和结构。

a维恩图显示了两组之间共有和独特的物种。b两组之间 alpha 多样性（Chao1、Shannon 指数和 Simpson 指数）的比较。c基于 Bray-Curtis 距离、二进制 Jaccard 距离和欧几里德距离比较两组之间的 beta 多样性。3D-PCoA 图显示了基于三个距离矩阵的两组细菌分类群的聚类，每个点对应一个样本并根据样本类型着色。PERMANOVA 显示结石侧的尿路生物组与非结石侧相似

图 3两组的细菌丰度和分布。条形图中表示了细菌门 ( a )、前 30 个最丰富的属 ( b ) 和种 ( c )的相对丰度

图 4两组之间细菌类群的差异丰度。

a箱线图显示，通过配对 Wilcoxon 检验，在非石头一侧增加了四个物种。b Cladogram 表示使用 LEfSe 识别的 24 个鉴别生物标志物的分类层次结构。c LDA 分数的直方图显示 24 个生物标志物在两组之间具有显着差异。LDA评分代表生物标志物的影响程度

图 5前30个最丰富的属（ a）和种（b）的Spearman相关分析的热图

图 6通过随机森林模型识别石组的基于物种的标记。

a交叉验证误差曲线显示，通过十倍交叉验证，选择了30个物种标记作为最佳标记集。b两组平均AUC值达到71.2%。c与对照组相比，结石组的 POD 值显着增加

KSD 是一种复杂的疾病，具有涉及环境和遗传因素的多因素病因。16S rRNA 基因测序和EQUC的应用表明，健康个体的泌尿道中栖息着复杂多样的微生物群落 [ 6-8 ]。从那以后，尿路生物组被证实与一些泌尿系统疾病有关 [ 9 , 10 ]。越来越多的注意力集中在 KSD 中的 urobiome 的作用上。众所周知，鸟粪石结石，即感染性结石，是由产生尿素的细菌引起的，例如奇异变形杆菌[ 25 ]]. 然而，临床研究发现，从所有类型的结石中分离出的细菌大多数是非尿素产生菌，而从患者的尿液和结石样本中分离出的细菌中最常见的是大肠杆菌，这表明代谢性结石（CaOx、CaP、尿酸等）也与尿液细菌有关[ 26、27 ]。最近，在结石形成者和健康个体之间观察到微生物群落组成的明显差异，进一步暗示了尿路生物组在结石形成中的潜在重要性 [ 11 – 14]. 但所有这些研究都应用了 16S rRNA 基因测序来分析 urobiome，结果大多没有解决属级以下的分类群。此外，大多数研究对结石形成者和健康对照者的膀胱尿路生物组进行了比较分析。然而，就解剖位置而言，肾盂尿液比膀胱尿液更能反映定植于肾脏的微生物群。一些研究人员收集了结石形成者的肾盂尿液进行测序 [ 11 , 13 , 28]，但目前还没有大样本研究比较单侧结石形成者有无结石的肾盂尿路生物组。在此，我们旨在使用 2bRAD-M（一种可以描绘该物种微生物群落景观的新型测序技术）来表征单侧结石形成者的肾盂尿路生物组，以探索结石侧和非结石侧之间是否存在微生物差异具有高精度和低成本的水平。

α多样性和β多样性均表明，结石肾盂尿液的总体微生物组成与无结石肾盂尿液的微生物组成相似。这些结果可能有多种可能性。首先，尿液收集过程中膀胱的污染可能导致结石侧和非结石侧之间的高度相似性。其次，虽然我们招募了初始结石发作的单侧结石形成者，但我们不能排除患者之前可能有双侧结石形成并且小结石可能从尿液中排出的可能性。由于非石方之前可能会形成结石，因此很容易理解双方具有相似性。第三，13]. 刘等人。采集肾结石患者四种尿液样本，包括膀胱消毒前吸出的膀胱尿、膀胱消毒后新形成的膀胱尿、膀胱消毒后结石侧肾盂尿和膀胱后非结石侧肾盂尿。消毒。他们对膀胱进行了仔细的消毒以防止污染，但他们发现四种类型的尿液样本具有相似的微生物丰富度和多样性。因此，我们假设石方的多样性与自然界中非石方的多样性相似，因为它们都来自同一主题。两组之间可能存在一些差异分类群，但两组的整体微生物群落没有显着差异。虽然杨等人。28 ]。

丰度概况表明，两组之间不同分类水平的优势细菌组成非常相似。一些细菌属，包括不动杆菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属和葡萄球菌属，之前也被报道为结石形成者肾盂尿液中的优势属[ 13、28 ]。值得注意的是，不动杆菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属是可引起 UTI 的重要机会致病菌。一些研究表明，与对照组相比，不动杆菌在结石形成者的膀胱尿路生物组中的比例过高 [ 11 ], 12 ]。发现石匀浆中以假单胞菌和葡萄球菌为主，通过 EQUC 从这些样品中分离出铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌[ 15 , 29 ]。尽管在之前关于 KSD 尿路生物组的任何研究中都没有报道主要的Cupriavidus属，但它与其他泌尿系统疾病有关。例如，Cupriavidus在膀胱癌组织中比在癌旁组织中更丰富 [ 30 ]。本研究鉴定出 451 种细菌，数量最多的前 5 种是C. pauculus、A. junii、A. sp_CIP_110321、S . paucimobilis和A. ursingii。这些物种主要存在于自然环境中，在人类感染中很少见报道。

Hong SY, Yang YY, Xu JZ, Xia QD, Wang SG, Xun Y. The renal pelvis urobiome in the unilateral kidney stone patients revealed by 2bRAD-M. J Transl Med. 2022 Sep 24;20(1):431. doi: 10.1186/s12967-022-03639-6. PMID: 36153619; PMCID: PMC9509602.

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