治疗癌症的TCR-T细胞：方法、数据和挑战

一、前言

同种异体血液和骨髓造血细胞移植(HCT)治疗恶性血液病和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗实体瘤的成功凸显了细胞免疫疗法为晚期癌症患者提供显着治疗益处的潜力，尤其是黑色素瘤。这些形式的治疗具有风险和技术挑战，包括在异基因HCT的情况下可能致命的移植物抗宿主病(GvHD)以及无法为多达50%的患者分离和成功制备TIL。此外，虽然对TIL治疗的高频率临床反应充分证明了癌症的自体T细胞治疗是可能的，但TIL的治愈率非常低，并且可能受到具有低亲和力TCR的肿瘤反应性T细胞的流行的限制。由于胸腺选择以及免疫抑制机制的重建而产生的相关抗原(TAA)。对于以基因组不稳定性为特征且患者肿瘤特异性新抗原水平较高的肿瘤，TIL的治疗潜力可能更大。关键免疫检查点（例如CTLA-4/CD80和PD-1/PDL-1）的识别以及阻断这些抑制性受体和途径的抗体（例如ipilimumab、nivolumab、pembrolizumab）的开发导致了持久的全身反应在患有各种晚期实体瘤（包括黑色素瘤、肺癌和头颈癌）的患者中——这是癌症治疗史上前所未有的事件。尽管如此，这种疗法的总体影响可能仍然受限于患者体内自然产生的内源性T细胞的有限谱系和低亲和力。因此，为了克服这些限制，将肿瘤特异性工程到患者自身的T细胞中仍然有很强的理论基础。

对TCR结构和功能的理解以及合成生物学和细胞转导方法学的进步已经融合在一起，使得对患者衍生的T细胞进行工程改造以表达新的受体或受体构建体成为可能，这些受体或受体构建体可以将T细胞重定向到已知的肿瘤靶标。Eshhar和他的同事是第一个证明通过基因修饰引入肿瘤特异性“T-body”或“CAR（嵌合抗原受体）”构建体可以将T细胞重定向到肿瘤的人之一。通过一系列优化实验进展，这些和其他研究人员已经产生了针对B细胞抗原CD19的第二代和第三代CAR，这些CAR在晚期和难治性慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤，也许还有最令人印象深刻的复发和耐药性儿童和成人急性淋巴细胞白血病(ALL)。虽然CAR方法提供了一种不受HLA限制的细胞免疫治疗策略，从而扩大了可以用每种结构治疗的患者范围，同时避免了肿瘤中MHC下调的问题，但存在一些限制和临床挑战：CAR工程T细胞的肿瘤抗原必须在细胞表面表达，并且在关键的非肿瘤靶器官和组织中不存在。此外，由CD3-zeta细胞质结构域和一个或多个共刺激结构域（例如，CD28或41BB或两者）组成的CAR的“非生理”信号传导机制可能导致快速增殖和细胞因子释放综合征(CRS)，其需要仔细的临床管理，有时可能是致命的。然而，其他因素，包括靶抗原的密度和可及性以及肿瘤细胞的分布，也可能与过继转移CAR T细胞和TCR工程T细胞后T细胞的增殖和CRS的发生有关。

使用TCR工程T细胞的免疫治疗涉及到编码TCRα链和β链的基因结构的转移，这些基因结构识别从TAA加工并在HLA分子环境中表达的8-10个氨基酸多肽。到目前为止，在人类身上测试的最常见的人类白细胞抗原限制性TCR是针对人类白细胞抗原-A*02:01的，它在大约50%的高加索人、大约40%的拉美裔人和大约20%-24%的非裔美国人中被发现。HLA-A*02:01在日本人中的频率约为22%，在美国亚洲人中约为18%，在中国人中高度可变(0-24%)。由于这些肽可以从细胞内和细胞外蛋白质中提取，因此TCR工程T细胞可以识别的TAA范围估计比CAR高5到10倍，部分原因是只有大约28%的细胞蛋白全部或部分表达在细胞膜上。此外，这些TCR工程的T细胞通常使用生理信号通路，这可能提供相对于CRS的安全的优势。在本文中，将讨论肿瘤特异性TCR的发展，它们的临床应用和安全性考虑，以及未来的发展方向。

二、TCR结构和功能

生理T细胞反应主要取决于克隆型α-β TCR和同源肽-MHC之间的分子间相互作用。这种相互作用通过分别与MHC II类和I类分子的特定恒定区结合的CD4和CD8以及T细胞上的CD2和CTLA-4和CD28以及CD58（对于CD2）和抗原呈递或肿瘤靶细胞上的CD80（用于CTLA-4和CD28）。TCR和肽-MHC复合物(pMHC)之间的界面涉及pMHC表面和α和β链的三个高变互补决定区(CDR)。CDR1α和CDR2α区由47个TCRα种系可变基因之一编码，而CDR1β和CDR2β区由57个TCRβ种系可变基因之一编码。CDR2环主要接触MHC分子，而CDR1环可以接触MHC和肽。另一方面，α和β链的CDR3α和CDR3β环由可变（V）、多样性（仅D、β链）和连接（J）片段编码，并通过随机核苷酸插入进一步酶促多样化VDJ基因片段的连接区域。正如预测的那样，高变CDR3α和CDR3β环主要与抗原肽接触。总而言之，TCR生成机制可以产生约10^15到10^20个独特的α和β对，能够识别大量抗原结构。T细胞表面上的TCR以一定的亲和力与pMHC结合，该亲和力在T细胞个体发育期间确定。在胸腺中的T细胞发育和成熟过程中，带有与同源抗原结合过强的TCR的T细胞被负选择消除，而结合过弱的T细胞则被细胞凋亡消除。更具体地说，早期双阳性（CD4+/CD8+）T细胞首先通过与胸腺皮质上皮细胞表达的肽-MHC分子相互作用而被阳性选择，而在胸腺的髓质中，单阳性（CD4+/CD8-或CD4-/CD8+)T细胞遇到髓质上皮细胞，这些细胞表达大量来源于在所有体细胞组织中表达的基因的肽。作为这种相互作用的结果，带有与自身肽表现出高亲和力相互作用的TCR的T细胞被阴性选择。这种亲和力成熟过程导致大量TCR在MHC的背景下与其同源抗原结合，如果源自非自身（例如微生物）抗原，则强烈，但如果源自自身抗原（解离常数或KD~0.1至500μM或更大）。值得注意的是，抗体通常以nM或pM范围内的KD值结合它们的同源抗原。

这种编辑机制显着降低了自身免疫性疾病的风险，但反过来也限制了天然免疫系统识别TAA的能力，因为在大多数情况下，这些肽来源于在肿瘤中重新表达或过表达的自身蛋白。这种T细胞本体模型有助于解释癌症疫苗接种策略缺乏成功的原因，这些策略迄今为止产生的临床益处有限，在NIH接受各种癌症疫苗的1300多名患者中，客观反应率为3.3%。它还解释了对病毒和癌症特异性TCR观察到的不同亲和力范围，与结合病毒抗原的TCR的亲和力明显高于癌症相关抗原。一般而言，TCR对作为“自身”抗原的癌症相关抗原的结合亲和力比TCR对非自身和微生物抗原的结合亲和力低约10倍。

另一个重要原则是TCR与其同源pMHC的亲合力和相互作用的动力学是T细胞活化的主要决定因素。使用表面等离子共振(SPR)和等温滴定量热法等技术，已经计算了数十种TCR-pMHC相互作用的生物物理特性。在这项工作的基础上，开发了两种主要的T细胞活化模型：“亲和模型”，它提出T细胞活化的水平取决于与肽-MHC复合物结合的TCR总数和“半生命模型”，其中最佳T细胞活化要求TCR以足够的结合强度和时间与肽-MHC复合物结合以诱导信号传导。因此，产生对同源肿瘤抗原具有更高亲和力的TCR的策略可能会导致优异的治疗效果，特别是当与那些亲和力增强的TCR在细胞毒性T细胞上的强制表达相结合时。事实上，多个研究人员已经表明，在生理TCR亲和力范围内（KD~200μM至1μM）以及在大多数情况下典型的肽-MHC复合物含量低的情况下，TCR对同源肽-MHC复合物的亲和力增强肿瘤导致T细胞功能改善。另一方面，超生理逻辑范围（KD<1μM）的亲和力增强通常会导致功能障碍，部分原因是共刺激分子的表达减少，同时伴随着PD-1表达增加和SHP-1和SHP-上调。2种用于下调T细胞功能的磷酸酶。进一步增强对KD<1nM水平的亲和力可能导致与其他肽-MHC复合物的交叉反应。因此，出现了一个总体原则，即给定TCR的最佳功能（包括T细胞活化和靶标特异性）发生在特定的结合亲和力窗口内。在上述TCR亲和力的生理范围内，无法预测每种TCR-p-MHC复合物对最佳T细胞功能的特异性亲和力，必须在每种情况下凭经验确定。

三、治疗性TCR的分离和功能增强策略

最初通常通过从患者肿瘤中分离TIL来确定用于治疗应用的候选TCR。为了说明为治疗应用生成TCR的过程，描述了为衍生自癌症睾丸抗原(CTAg)NY-ESO-1和LAGE-1的天然加工肽生成亲和力增强TCR所采取的步骤在一些细节。这个过程涉及实验迭代和意外发现。在T细胞可以靶向的各种类型的TAA中，CTAg或癌种系抗原(CG)很有吸引力，因为它们的表达谱相对清晰，主要限于生殖细胞和癌症。此外，这些抗原在发生特定癌症的患者中所占比例不定但很大，有些可能会促进癌细胞存活并赋予化疗耐药性，从而增加靶向这些抗原的潜在临床益处带有TCR修饰的T细胞的抗原。其他类型的TAA，包括组织分化或谱系特异性抗原和源自患者特异性突变的新抗原可能不是TCR工程T细胞的理想靶标，因为“off-tumor”表达会导致正常组织损伤并应用于非常小的患者人数。

NY-ESO-1最初是通过一种称为来自人类肿瘤的重组cDNA文库的血清学表达克隆(SEREX)的方法被鉴定为推定的人类肿瘤抗原，该方法使用从患有食管鳞状细胞癌的患者获得的组织，NY-ESO-1的功能未知。在睾丸、卵巢和子宫标本中检测到NY-ESO-1表达较弱，但在任何其他正常组织中通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不到mRNA。NY-ESO-1(CTAG-1B)是一种免疫原性癌症睾丸抗原(CTA)，与可导致临床癌症反应的自发和疫苗诱导的免疫相关。据报道，高达60%的晚期骨髓瘤表达NY-ESO-1，这是与肿瘤增殖和高风险特征相关的特征。

除骨髓瘤外，多种实体瘤以高达50%的比率表达NY-ESO-1，包括黑色素瘤和膀胱癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌和食道癌。不同研究报告的表达率不同；RT-PCR比免疫组织化学(IHC)更敏感，并且倾向于为NY-ESO-1表达提供更高的数字。来自IHC的数据更可靠，因为这种技术检测的是蛋白质而不是RNA。像NY-ESO-1这样的CTAg的一个特征是它们可以在肿瘤中具有异质表达，因此通过基于RNA或蛋白质的方法在组织切片中测量这两个方面是有益的。识别HLA-A*0201限制性表位NY-ESO 157-165 (SLLMWITQC)的CTLs已经从几个不同组的骨髓瘤患者的血液和淋巴结中生长出来。LAGE-1是一种高度同源的TAA，其表达模式与NY-ESO-1非常相似，也具有相同的表位，并且针对该表位的特异T细胞克隆也可以杀死抗原阳性肿瘤细胞。

TCR基因cDNA序列从NY-ESO-1 HLA-A*0201中分离出来SLLMWITQC限制性T细胞克隆1G4。该CTL克隆是从一名患有黑色素瘤的81岁女性的转移性淋巴结中培养出来的，该女性对自体肿瘤细胞表现出强烈的血清学和细胞溶解反应。发现CTL克隆(1G4)以HLA-A*02:01限制的方式识别对应于NY-ESO-1的氨基酸157-165的SLLMWITQC肽。请注意，SLLMWITQC肽序列与LAGE-1抗原衍生和表达的序列相同，因此LAGE-1抗原阳性肿瘤也被1G4 T细胞克隆靶向。

将α和β链TCR蛋白的成熟细胞外区域的cDNA编码序列克隆到单独的大肠杆菌质粒载体中并表达为蛋白质包涵体。将这些包涵体纯化，溶解，然后重折叠为可溶性α/β异二聚体TCR蛋白（sTCR）。两条TCR链在天然链内半胱氨酸残基之前的C末端被遗传截短，并通过在α和β链TCR恒定区之间工程化的人工二硫键连接在一起。纯化1G4-sTCR蛋白，并使用BIAcore 3000通过表面等离子体共振（SPR）分析其HLA-肽抗原结合动力学。1G4基因序列还用作平台，使用大量突变的1G4 TCR蛋白的噬菌体展示产生具有增强的抗原结合亲和力的变体。

HLA-A*0201-SLLMWITQC-肽抗原复合物是验证1G4 T细胞克隆和可溶性版本的抗原结合以及测试和选择噬菌体展示产生的亲和力增强变体所必需的。该复合物是通过将HLA-A*0201蛋白和β2微球蛋白克隆到大肠杆菌表达载体中而制成的。然后这些蛋白质在溶解、与SLLMWITQC肽混合并重折叠之前分别表达为蛋白质包涵体。然后通过离子交换和尺寸排阻色谱法纯化重折叠的pMHC抗原复合物。

构建了一个1G4 sTCR噬菌体展示文库，其突变覆盖了β链的高变互补决定区（CDR3区）。对高亲和力TCR克隆进行了三轮选择/富集。高亲和力突变TCR噬菌体的竞争ELISA测定鉴定了几种候选TCRβ链CDR3突变。这些高亲和力β链突变体随后形成了文库的基础，其中CDR3α链也以类似方式突变。然后使用这个复杂的文库来分离更高的亲和力。后来，突变被引入两条链的CDR2区域，然后重新选择这些文库。

四、亲和力增强型NY-ESO-1 sTCR克隆的生化验证和功效检测

将高亲和力突变TCRα和β链基因分别克隆到大肠杆菌表达载体中。这些突变TCR链在各种配对组合中表达和重折叠，包括野生型链。然后将它们纯化并通过SPR分析与HLA-A*0201-SLLMWITQC抗原的结合。如前所述，使用高亲和力TCR转染的T细胞的早期研究表明，具有非常高亲和力的TCR可能表现出功能减弱和靶标特异性改变，这表明应优先评估亲和力适度增加的TCR。因此，高亲和力突变CDR3α链TCR序列和突变CDR2β链TCR序列部分反向突变为野生型1G4 TCR序列。然后在TCR转染的T细胞中评估一组这些噬菌体衍生的1G4 TCR突变体。从这些数据中，选择在抗原结合区具有单或双氨基酸取代且预期具有最佳细胞特性的TCR用于慢病毒T细胞转导和功能研究中的比较。这些研究包括针对一组NY-ESO-1阳性和阴性肿瘤细胞系的细胞因子释放测定和细胞毒性测定。从这些研究中，基于增强的结合特性、增强的细胞因子释放和靶细胞杀伤以及抗原特异性的保留，亲和力增强的NY-ESO-1 TCR构建体成为“赢家”。该构建体由在1G4 NY-ESO-1 TCR克隆的CDR3区域的95位（苏氨酸→亮氨酸）和96位（丝氨酸→酪氨酸）处携带氨基酸取代的α链变体(c259)与野生1G4 NY-ESO-1 TCR克隆的β链。这种亲和力增强的TCR的T1/2为19s，Kd为730 NM，而野生型1G4TCR的T1/2为2.2秒，Kd为9.3μM，表明1G4 NY-ESO-1 TCR变体c259的“停留”时间和结合强度大约是c259的10倍。

应该指出的是，其他研究人员已经采取了结构方法，从TCR-肽-MHC复合物的晶体结构开始，以阐明接触点。然后可以基于结构相容性以逻辑方式而非随机方式进行氨基酸取代，以实现亲和力增强。这种方法还导致开发用于NY-ESO-1[157-165]的HLAA*02:01限制性TCR的亲和力增强变体。此外，还开发了一种高通量TCR基因捕获方法，以更快速地从人类肿瘤组织中分离和鉴定肿瘤抗原特异性TCR序列，无论是否事先了解抗原特异性。该方法用于开发CTAg特异性TCR库，还可以促进针对个体患者肿瘤表达的私有新抗原的TCR工程T细胞免疫疗法。

然后在免疫缺陷NSG（NOD/scid/γc无效）小鼠模型中评估用HLA-A*02:01限制性TCR的亲和力增强变体转导的T细胞对NY-ESO-1[157-165]的细胞毒性作用使用人B细胞前体急性淋巴细胞白血病细胞系（NALM-6）作为肿瘤靶标。免疫缺陷的NOD/scid/γc无效（NOG）小鼠是测量人CD4T细胞体内再增殖的优秀异种移植模型。植入后，人造血细胞可在NSG小鼠中维持至少2个月或直至致命的异种GvHD。将NALM-6静脉内注射到NSG小鼠中提供了在20-23天内快速向动物死亡进化的全身性肿瘤模型。亲本NALM-6细胞表达HLA-A1和HLA-A2分子，并且还表达低水平的某些癌症-睾丸抗原，包括MAGE A3，但不表达NY-ESO-1抗原。为了实现该抗原的更高表达，用表达NY-ESO-1蛋白的慢病毒与绿色荧光（GFP）蛋白（NALM6-GFP，NY-ESO-1）一起转导NALM-6细胞。作为对照细胞系，仅用GFP（NALM6-GFP）转导NALM-6细胞。在先前的实验中，类似于亲本NALM-6细胞，NALM6-GFP-NY-ESO-1细胞在23天内诱导小鼠死亡。

功效研究使用了亲本和转导的NALM-6细胞系，并评估了通过慢病毒转染进行基因修饰以表达NY-ESO-1 TCR的CD4和CD8 T细胞对动物存活的影响。注入的研究细胞数为5×10^6 CD4和CD8 T细胞。该剂量是根据NALM-6模型中的试验数据选择的，这表明这是观察抗肿瘤作用所需的有效剂量。由于人类平均比普通小鼠大3000倍，因此小鼠中5×10^6个细胞的细胞剂量大致相当于人类约100亿个细胞的剂量。人体试验的起始剂量预计约为1×10^9，因此在临床前小鼠实验中评估的剂量大约是I期试验中人体剂量的10倍。

正如预期的那样，所有对照小鼠（注射盐水和模拟/未转导的T细胞）在第19天和第23天之间死亡。此外，当小鼠接种NY-ESO-1阴性NALM6肿瘤细胞时，高亲和力的NY-ESO-1 TCR(c259)转导的T细胞没有给小鼠带来任何生存优势。然而，当携带NALM6-NY-ESO-1阳性肿瘤细胞的小鼠用NY-ESO-1-TCR转导的T细胞治疗时，无论TCR亲和力如何(wt或亲和力增强的c259 TCR变体)，都显示出显著的生存优势。这些数据表明，NY-ESO-1 TCR对表达同源抗原的肿瘤细胞具有有效的杀伤作用。

五、亲和力增强型NY-ESO-1(c259)TCR的临床转化

在将亲和力增强的NY-ESO-1(c259)TCR转移到临床的过程中，值得注意的其他几个考虑因素包括转导的T细胞功能的优化和临床前测试，以将off-tumor效应的风险降至最低。TCR修饰的T细胞靶向和杀伤肿瘤的两个潜在障碍包括转导的α和β链与天然T细胞α和β链“错配”的潜在问题，以及CD3信号复合体成分的有限可获得性。其次，任何TCR的错配和生理冗余都可能在HLA分子的背景下识别大量不同的肽，这可能导致“脱靶”识别和off-tumor毒性。功能性TCR的形成和表面表达需要新的α和β链配对，然后与CD3复合物的四个不变链结合，即CD3γ、CD3δ、CD3ε（两个亚基）和CD3ζ（两个亚基）。此外，CD3亚基特别是CD3ζ的可用性是有限的，并且部分形成了在内质网中降解的TCR-CD3复合物。体外研究表明，将新的TCR引入表达其天然TCR的淋巴细胞会导致外源性α和β链与内源性β和α链之间的错配，足以产生HLA I类或II类限制和定向的新反应性针对同种异体和自体靶标。此外，这种与自身反应性T细胞产生的错配被认为在使用异常强化预处理方案的小鼠模型中导致致命的GvHD。应该注意的是，迄今为止，尚未证明基于天然和外源TCR链之间的错配而在人类中发生已知的免疫毒性。减少错配和增强转导治疗性TCR表面表达和功能的潜在策略包括使用脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)序列或最近的“自切割”来自小核糖核酸病毒或猪特斯霍病毒的2A序列，它允许核糖体从一个链序列跳到相邻的链序列，以实现每条肽链的几乎等效的翻译和产生。增加外源TCR链优先配对的另外两种策略包括引入第二个半胱氨酸残基以在引入的α和β链之间产生额外的二硫键，以及使用鼠类TCR序列促进物种特异性配对。促进外源性TCRα和β链等摩尔合成的分子技术已被用于开发用于人类研究的治疗性TCR。

过继转移的TCR基因修饰的T细胞识别非肿瘤细胞上的同源多肽抗原而对正常组织造成损害，或识别非肿瘤细胞上的意外的“交叉反应”多肽或HLA分子而引起正常组织损伤而引起正常组织损伤的“on-target, off-tumor”和“off-target, off-tumor”毒性问题可能是TCR工程T细胞毒性的更常见原因。这些毒性也将在临床研究的背景下进一步讨论。在临床前开发期间为减轻这些毒性而采取的步骤包括：(I)丙氨酸替代扫描，以确定抗原肽中的哪些氨基酸残基对TCR结合至关重要，从而确定TCR可能识别的其他基因中结构相似的多肽序列，随后进行结合试验以测试潜在的交叉反应；(II) 针对“同种异体反应小组”测试TCR，以寻找与除已知TCR结合的分子外的其他HLA分子的交叉反应性；(III)针对一大批原代细胞和组织进行TCR检测；(IV)仔细评估靶抗原的真实分布，以最大限度地减少“on-target/off- tumor”效应的风险。如前所述，on-target/off-tumor毒性和off-target/off-tumor毒性也将在临床研究的背景下进一步讨论。

六、TCR基因工程淋巴细胞的早期临床研究

用于癌症免疫治疗的TCR工程T细胞的第一项临床试验集中于黑色素细胞分化抗原MART-1，该抗原在80-90%的黑色素瘤病例中表达，并经常被黑色素瘤TIL识别。使用从黑色素瘤TIL中分离的TCR，它是HLA-A*02:01限制并识别MART-1:27-35表位AAGIGILTV，研究人员将该TCR的cDNA克隆到逆转录病毒中，然后从15个自体外周血淋巴细胞中转导HLA-A*02:01+晚期黑色素瘤患者(Morganetal.2006)。在通过各种机制增强T细胞免疫疗法的影响的骨髓抑制治疗后，这些患者接受了转导的T细胞，然后使用IL-2进行维持治疗。在接受治疗的15名患者中，1名患者完全消退，持续了23个月，而另一名患者的腋窝肿块完全消退，10个月后切除的肝脏病变缩小了90%，患者在治疗后9年保持无病。

为了提高响应率，MART的亲和力更高的TCR被识别和测试。MART-1:27-35 AAGIGILTV的TCR从24名黑色素瘤患者的TIL中分离出来，并测试了转导淋巴细胞对HLA-肽复合物的亲和力和IFNγ的产生。一种称为DMF5的特定TCR表现出最强的反应，并被选择用于进一步的临床开发(Johnsonetal.2006)。对另一种黑素细胞分化抗原gp100的类似临床前研究导致开发和选择了针对gp100:154-162表位KTWGQYWQV的相对高亲和力TCR，该表位是从HLA-A*02:01+-产生的T细胞克隆中分离出来的。已用gp100:154-162表位免疫的转基因小鼠。用表达高亲和力MART-1TCR(DMF5)的自体T细胞治疗患者，20名晚期黑色素瘤患者中有6名(30%)和16名接受自体TCR的患者中有3名(17%)出现客观反应用高亲和力gp100TCR转导的淋巴细胞(Johnsonetal.2009)。在这两项研究中接受治疗的36名患者中，34名最终复发，而1名患者在接受MART-1:27-35 TCR治疗近8年后持续部分缓解，另一名患者在接受gp100:154-162 TCR治疗近8年后持续完全缓解。

重要的是，在接受同时表达MART-1和gp100 TCR的细胞治疗的大多数患者中，观察到了严重的“on-target, off-tumor”毒性，包括36名患者中的29名，最终导致大多数表皮黑素细胞的丧失(Robbins 2015)。此外，接受MART-1 TCR修饰T细胞的患者中有11/20发生葡萄膜炎，接受gp100 TCR基因修饰的T细胞的患者中有4/16发生葡萄膜炎；在15名受影响的患者中，有13人成功地使用类固醇眼药水治疗。接受MART-1 TCR表达T细胞治疗的20例患者中有10例发生急性听力损失，接受gp100 TCR表达T细胞治疗的16例患者中有5例发生急性听力损失，而36例患者中有9例出现眩晕，可能是由于工程性T细胞对内耳黑素细胞的攻击；所有患者对鼓室内注射类固醇有反应(Robbins 2015)。在后一项研究中，较高的客观应答率和靶上/瘤外毒性比率表明，亲和力增强可能会增加TCR修饰的T细胞的效力。

进行了另一项临床试验，涉及T细胞的过继转移，这些T细胞被设计用于表达HLA-A*02:01限制性免疫原性肽的亲和力增强TCR，该肽由来自大多数癌症的癌胚抗原(CEA)中的氨基酸691-699组成。结肠癌以及在隐窝中发现的正常结肠上皮细胞。该TCR还在TCRα的CDR3区域的密码子112处包含丝氨酸→苏氨酸取代，这似乎增强了CEA肽对结肠癌细胞系的识别。使用CEA691-699定向表达TCR的T细胞治疗具有高水平循环CEA的HLA-A*02:01+患者在三名患者中的一名患者中引发了6个月的部分反应，但可预测地导致一名患者出现严重炎症性结肠炎和1级腹泻，但2名患者出现3级腹泻，需要在三名患者中的两名患者中给予口服皮质类固醇。虽然这些自身免疫性毒性在4-6周内消退，但试验提前终止。自体T细胞经工程改造以表达针对在肿瘤和正常组织对应物上表达的谱系特异性或“分化”抗原的TCR的临床经验表明，偶尔可以获得临床反应，这些反应有时是持久的，但益处似乎超过“on-target, off-tumor”的免疫毒性所抵消。对肿瘤组织缺乏选择性的部分原因可能是存在免疫抑制因子，这些因子在肿瘤床有效，但在正常组织中无效。这导致了使用T细胞进行研究，这些T细胞被设计为携带TCR，这些TCR针对主要或专门由肿瘤表达的抗原，包括癌睾丸抗原(CTA)或癌胚系抗原(CG)，最显着的是NY-ESO-1。

七、实体瘤中表达NY-ESO-1 TCR的T细胞的临床研究

NY-ESO-1癌-睾丸或癌-种系抗原在实体瘤中广泛表达，包括黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和膀胱癌，其表达频率在10%到50%之间。NY-ESO-1在滑膜细胞肉瘤中大量表达，甚至更频繁地表达，在大约60-70%的肿瘤中发现它。基于在滑膜细胞肉瘤和黑色素瘤中较高的表达频率和选择性，进行了一项临床试验，利用基因工程的自体T细胞表达1G4 NY-ESO-1 TCR的亲和力增强的HLA-A*02:01限制性(c259)变异体，该变异体携带α链CDR3区第95位(苏氨酸→亮氨酸)和第96位(丝氨酸→酪氨酸)氨基酸替换，与1G4 NY-ESO-1 TCR克隆的野生型β链结合。在用氟达拉滨和环磷酰胺进行淋巴清除化疗后，患者接受携带亲和力增强的NY-ESO-1 TCR的逆转录病毒转导的自体T细胞，然后进行IL-2维持治疗。6例HLAA*02：01阳性的滑膜细胞肉瘤患者中有4例和11例晚期黑色素瘤患者中的5例按RECIST标准有临床反应，其中2/11例黑色素瘤患者的完全反应持续1年以上，1例滑膜肉瘤患者部分反应持续18个月。最近的一份报告使用了扩大的患者队列和更长的随访时间的类似实验设计，包括18名进展性滑膜细胞肉瘤患者，其中11人有客观反应，20名晚期黑色素瘤患者，其中11人有客观反应(Robbins et al. 2015)。滑膜细胞肉瘤患者的预计3年和5年总生存率分别为38%和14%，而黑色素瘤患者在这两个时间点的预计生存率均为33%。利用这项更大规模的研究，研究人员试图确定反应的预测因素。尽管这项研究中的一些患者也接种了来自NY-ESO-1[157-165]表位的多肽疫苗，但这种疫苗的接受与应答无关，而较高的T细胞数量和一项增强功能的指标（多肽脉冲EB病毒转化的淋巴细胞靶点产生干扰素γ）似乎确实与更好的临床应答相关。重要的是，没有观察到转导的T细胞的毒性，这与NY-ESO-1对肿瘤和生殖细胞的限制表达一致。

八、骨髓瘤中表达NY-ESO-1 TCR的T细胞的临床研究

据报道，高达60%的晚期骨髓瘤也表达NY-ESO-1，这一特征与肿瘤增殖增强和其他高危特征有关，包括复发和髓外疾病。大剂量化疗和自体干细胞移植(AHCT)一直是骨髓瘤治疗的主要手段，在AHCT治疗骨髓瘤和其他血液肿瘤后取得了更好的临床结果，这可能与移植后淋巴细胞的快速恢复有关。此外，骨髓瘤患者的骨髓和血液中存在低频率的肿瘤反应性T细胞，它们可能在激活时以骨髓瘤细胞为靶点。因此，自体免疫介导的骨髓瘤控制是可能的。

我们和其他研究人员研究了AHCT后接种的癌症疫苗是否具有免疫原性并改善结果。我们的研究涉及细胞和疫苗相结合的策略，假设体外共刺激自体T细胞的转移将促进功能T细胞的恢复，从而为增强疫苗定向免疫反应提供平台。在这些研究中，自体T细胞与免疫磁珠共培养，免疫磁珠与抗CD3和抗CD28单抗结合，通过结合CD3和CD28信号来防止T细胞无反应性。使用包括肺炎球菌结合疫苗(Prevnar®)和流感疫苗以及基于hTERT和Survivin多肽的癌症抗原疫苗在内的微生物疫苗，这些研究表明，移植后早期输注1-5×10^10体内和体外共刺激T细胞，然后加强免疫，在大多数患者中导致保护性抗微生物抗体反应，在大约三分之一的患者中导致癌症疫苗指导的T细胞反应。在MAGE-A3肿瘤抗原疫苗中加入新型佐剂，如Toll样受体-3激动剂Poly-ICLC (Hiltonol®)，可在超过2/3的患者中产生功能性T细胞反应，对于同时对CD 4+和CD 8+T细胞产生干扰素-γ反应的患者，EFS显著提高。此外，还观察到了一种依赖时间表的T细胞扩增模式，即当体外共刺激T细胞在大剂量化疗后很早（自体干细胞移植后的+2天，而不是+14天或+100天）输注时，AHCT后CD4+和CD8+T细胞的恢复最为强劲，这可能是由于淋巴耗竭化疗后普遍存在的稳态扩张机制(例如，未结合的IL-15)。利用这一平台，我们进行了一项I/II期临床试验(NCT01352286)，旨在评估经基因工程处理后表达亲和力增强TCR（NY-ESO [c259]）的自体T细胞的安全性和活性，该TCR可识别NY-ESO-1/LAGE-1肽复合体HLA-A*0201-SLLMWITQC（NY-ESO-1[157-165]）并在AHCT后输注。高危或复发性多发性骨髓瘤(MM)患者，HLA*A0201阳性，定量qRT-PCR检测NY-ESO-1和/或LAGE-1阳性。图1显示了该临床试验的流程图。简单地说，用抗CD3/抗CD28抗体偶联的微球激活和扩增CD25缺失的自体CD4和CD8T细胞，并用编码亲和力增强的NY-ESO-1/LAGE-1 TCR的自失活慢病毒载体进行基因修饰。在大剂量melphalan后4d和自体HCT后2d(AHCT+2d)注射工程化T细胞，剂量范围为10~100亿个总细胞。我们假设过继转移NY-ESO[c259] TCR工程T细胞将改善晚期MM患者AHCT后临床反应的持续时间和深度。

图1 进行自体白细胞分离术。CD25缺失的CD4和CD8 T细胞用抗CD3/抗CD28抗体偶联的微球激活和扩增，并用编码亲和力增强的NY-ESO/LAGE-1 TCR的自失活慢病毒载体进行基因修饰。在大剂量melphalan后4天或自体HCT后2天(AHCT+2天)注射工程T细胞，剂量范围为10-100亿个总细胞

在研究入组之前，患者接受过三次治疗的中位数(范围1-4)，其中包括五次先前接受AHCT的治疗。60%(12/20)的肿瘤含有细胞遗传学异常，其中大多数被认为是高风险的。20名患者(中位年龄58岁，范围44-72岁)接受了平均80亿总CD3 T细胞(范围10-100亿)的基因改造，平均为33%(范围18-49%，最低研究为10%)。因此，平均有24亿个转导的CD3 T细胞被输注(范围为4.5亿-39亿)。输注耐受性良好，尽管所有患者在输注后7-28天内血清IL-6显著升高(中位数22倍；范围8-2272倍)，但没有检测到临床上明显的CRS，这与T细胞最大扩张期重叠。用流式细胞仪检测细胞因子的产生(干扰素-γ)和细胞毒活性(颗粒酶B的产生和CD107α的表面表达)对多肽负载靶标的反应。数据显示，在制造过程中产生的多功能T细胞移植到患者体内，在输注后它们在外周血中保持功能长达一年。

大多数不良事件与大剂量melphalan有关。重要的是，没有与治疗相关的死亡。所有严重不良事件(SAEs)(5)都得到解决，至少可能与治疗有关的17个不良事件为3级或更低。值得注意的是，3/20名患者出现了皮疹和淋巴细胞增多，一些患者因melphalan诱导的粘膜炎而出现腹泻综合征，其中3例经活检证实为自体移植物抗宿主病(AutoGvHD)。然而，在患有自体移植物抗宿主病的患者中，对炎症和正常结肠组织和外周血液中的工程化T细胞进行了分析，尽管工程化T细胞存在于炎症组织中，但与邻近的非炎症组织相比，它们在炎症部位被稀释，这表明它们并不是推动这一事件的因素。此外，我们以前观察到过继转移激活但非基因修饰的T细胞后，累及胃肠道的急性移植物抗宿主病(aGvHD)。

这一高危队列的中位无进展生存期(PFS)为19.1个月（95%可信区间下限为8.5个月，上限尚未达到），而15/20(75%)患者在初次报告时仍存活。Q-PCR和/或流式细胞仪检测结果显示，除1例患者外，所有患者体内的工程化T细胞均可扩增、转运至骨髓，并持续至少6个月。2例患者输注后2年以上的血液或骨髓中均可检测到工程化细胞。这种持续时间对于TCR基因修饰的T细胞和一般的基因修饰的T细胞来说是不寻常的，并且可能反映了在AHCT环境中的过继转移(在强化淋巴去除化疗之后)、转导的T细胞的体外共刺激的使用和/或NY-ESO-1-TCR的性质和表达载体。抗原阳性骨髓瘤细胞的特异性靶向证据来自几个方面：与入组水平相比，在第100天对骨髓标本进行qRT-PCR分析的12/15名患者和在180天的11/13名可评估患者中观察到NY-ESO-1和LAGE-1转录本的丢失。相反，在第100天骨髓中检测到NY-ESO-1和LAGE-1转录本水平的15名患者中，有3名患者的外周血液中工程T细胞水平非常低或检测不到，随后两名患者复发。在没有NY-ESO-1/LAGE-1转录本的情况下，4名患者的CD138转录本(作为一般浆细胞的衡量标准)增加，这表明来自免疫反应的压力可能会选择缺乏靶向肿瘤抗原的肿瘤逃逸亚克隆。2例基因修饰的T细胞持续存在的患者出现了持久的部分反应，与残留的NY-ESO-1/LAGE-1阴性的骨髓瘤细胞相关，也与抗原阴性的肿瘤逃逸现象一致。此外，在统计学的基础上，从移植后0到180d，外周血中转基因T细胞的持续时间与骨髓中NY-Eso-1的表达水平呈负相关(p=0.022)，可能与LAGE-1的表达水平(p=0.098)呈负相关。相反，随着时间的推移，T细胞在血液中的持久性与骨髓中CD138的表达(反映总浆细胞)之间没有关系。总之，这些数据表明诱导了一种强大的、肿瘤抗原特异性的记忆免疫反应。

九、TCR工程T细胞治疗的风险：MAGE-A3和MART-1的经验

TCR修饰的T细胞治疗的三大类毒性包括(1) on-target/off-tumor毒性，(2) off-target/off-tumor毒性，(3)可能由T细胞过度激活引起的CRS。前面描述的使用亲和力增强的MART-1(DMF5)和gp100 TCR工程T细胞的临床研究充分说明了T细胞对皮肤和内耳正常黑素细胞的攻击所导致的“on-target/off-tumor毒性”的例子。这些研究表明，针对线性特异性或组织分化抗原的TCR免疫疗法的进一步发展可能是困难的。以下研究提供了“off-target/off-tumor毒性”的例子。

还开发和实施了一项伴随骨髓瘤的试验，该试验涉及AHCT后过继转移自体T细胞，该T细胞表达针对HLA-A*01限制性MAGE-A3肽(EVDPIGHLY)复合体的亲和力增强的TCR。这一高亲和力的MAGE-A3 TCR (MAGE-A3[a3a] TCR)在CDR2区的α链上有4个替换，而β链仍然是野生型。与NY-ESO-1亲和力增强型TCR一样，MAGE-A3 TCR经历了广泛的临床前开发，包括合成生物学、生物物理和免疫学测试，以及对正常组织和细胞的广泛筛选。在大剂量melphalan (第2天)、AHCT(第0天)和T细胞输注(第2天)后，本研究中第一个接受治疗的患者在+3到+5天出现心源性休克并伴有发热、缺氧和低血压，并在T细胞转移后5天(+7天)死亡。外周血MAGE-A3[a3a]TCR序列的聚合酶链式反应分析显示，体内基因修饰的T细胞在体内的扩增能力很强，仅在T细胞转移后3天就超过了400cell/μl。到患者死亡时，被转导的T细胞在体内估计已经扩大了约200倍。转导的T细胞定位于骨髓、肺、心脏和肝脏，但在血液和心包液中浓度最高。尸检可见广泛的心肌坏死，心肌内有明显的CD3+淋巴细胞浸润；骨骼肌或其他受检器官未见类似的浸润。血液和心包液的细胞因子分析与免疫细胞激活一致(包括干扰素-γ增加~100倍，IL-6增加~1000倍)。在另一名患有黑色素瘤并接受MAGE-A3[a3a] TCR转导的T细胞的患者中，观察到了类似的临床过程和心脏组织病理学。使用丙氨酸扫描方法来描绘MAGE-A3肽EVDPIGHLY中关键的TCR结合残基的优雅的体外SAE后研究最终确定来自非常大(3兆吨)的心肌蛋白Titin的一种肽(ESDPIVAQY)可能是off-target/off-tumor TCR交叉反应的目标。有趣的是，广泛的临床前试验没有发现off-target活性的问题，而SAEs后对38个心脏来源的原代细胞(包括10个人类白细胞抗原A*01+的细胞)的检测没有证据表明干扰素-γ ELISpot分析激活了MAGE-A3[a3a]TCR转导的T细胞。对亲和力增强的TCR表现出强烈反应性的唯一模型是icell心肌细胞培养系统，该系统来自诱导的多能干细胞，包括自发电活动的心房、结节和室样肌细胞的混合物，这可能更能代表正常心脏组织。

在另一项使用针对MAGEA3：112-120肽的亲和力增强的HLA-A*02:01 TCR(KVAELVHFL)的临床试验中，7名接受化疗的黑色素瘤患者中有2名完全缓解，1名持续4年以上，另外2名患者客观部分缓解。1例滑膜细胞肉瘤患者也出现部分缓解，持续5个月。然而，在三名患者中发生了严重的神经毒性，其特征是全部精神状态改变，两名患者癫痫发作，一名患者脑白质空泡化。一个可能的解释是，亲和力增强的TCR与来自MAGE-A12的多肽发生交叉反应，MAGE-A12在脑组织中低水平表达。然而，目前尚不清楚为什么这种神经毒性只在接受治疗的患者中观察到。这些研究既强调了亲和力增强的TCR工程T细胞的临床效力，也强调了严重甚至致命的off-target和off-tumor毒性的潜在危险。要提高这些试剂的安全边际，可能需要进行更复杂的临床前测试，使用(I)氨基酸(丙氨酸)扫描方法来确定关键的结合残基，从而扩大对人类基因组中潜在交叉反应多肽的搜索，以及(II)更相关的人体组织模型，例如来自诱导多能干细胞的器官样结构。

尽管不被认为像CAR T细胞试验中那样常见，但最近在一项对自体T细胞的研究中报告了一种死亡，显然是由于过度的T细胞激活引起的CRS，该自体T细胞被设计为表达MART-1的HLA-A*0201限制性26-35表位的TCR，该表位没有亲和力增强。1例巨大且广泛转移的黑色素瘤患者(包括18 cm腹膜后肿块，16 cm盆腔肿块，恶性腹水，脑和肺转移)，在环磷酰胺和氟达拉滨预处理后，用MART-1 TCR修饰的T细胞治疗。T细胞输注6天后，患者出现癫痫发作、脑出血和心脏骤停，几天后死于多器官衰竭和不可逆转的脑损伤。T细胞输注后，IL-6、干扰素-γ、C反应蛋白和降钙素原水平显著升高，提示CRS或T细胞过度活化。尽管基因修饰的T细胞广泛分布在已知的肿瘤部位以及包括心脏在内的多个重要器官中，但没有证据表明与任何实验模型的心脏组织有任何交叉反应，包括心脏跳动的心肌细胞培养。

十、使用TCR基因修饰T细胞的临床试验

许多临床试验已经证明了上述转基因TCR疗法治疗不同类型癌症的可行性和有效性，包括肿瘤消退在内的临床活动在相当一部分患者中得到了报道。这些早期研究催生了针对越来越多的肿瘤相关靶点的有前景的TCR试验的结果。表1列出了在NCI注册的临床试验。值得注意的是，这些试验中的一些还针对TAA的表位，如WT1，这些表位在正常造血干细胞中低水平表达，但在白血病中表达高得多。

十一、专家观点与未来发展方向

亲和力增强的TCR工程自体T细胞的治疗原理已经被充分证明，用于某些血液恶性肿瘤(例如骨髓瘤)和实体肿瘤(例如黑色素瘤、滑膜肉瘤)。在这种疗法能够更广泛地应用之前，还有几个挑战。将需要针对更多种类的新靶点开发高亲和力的TCR，包括来自已建立的肿瘤特异性基因的多肽，例如广泛表达的癌症-睾丸或癌症-生殖系抗原。其他候选基因可能是来自癌症特异性复发突变的多肽(例如，急性白血病中的IDH-1/IDH-2或实体肿瘤中的KRAS)或癌症特异性融合基因的共同断裂点区域(例如，慢性粒细胞白血病中的BCR-ABL)，因为这些突变也可能产生“共享的”肿瘤相关抗原肽。研究人员将需要通过提供TCR来解决限制人类白细胞抗原的固有问题，这些TCR超出了传统的和常见的靶标HLA-A*02:01和HLA-A*01之外的更广泛的人类白细胞抗原分子。如上所述，临床前试验需要大大扩展到研究细胞系和正常组织阵列之外，以确保这些强大的基于细胞的疗法有更大的安全边际。使用TCR修饰的T细胞和CAR T细胞进行成功的细胞免疫治疗的其他障碍包括癌症(特别是实体肿瘤)和肿瘤微环境抑制效应者免疫反应的无数机制，包括PDL-1、PDL-2和CTLA-4的表面表达，以及吲哚-2，3-双加氧酶(IDO)的产生，IDO耗尽色氨酸，增加犬尿氨酸，从而促进Tregs和髓系来源的抑制细胞(MDSCs)的形成。在这方面，包括PD-1、PDL-1和CTLA-4抗体在内的检查点抑制剂以及IDO酶的小分子抑制剂的出现可能为开发新的组合方法提供一条合理的途径。