快报 | 湖北省宜昌市结核分枝杆菌的遗传结构与传播风险分析

作者：纪律，陶凤茜，余云芳，刘建华，余枫华，白春林，万正杨，杨晓波，马静，周攀， 牛昭，周萍，向虹，陈明，向州，张芳琼，江琦，刘晓俊

第一作者及单位：纪律，宜昌市疾病预防控制中心公共卫生检验所；陶凤茜，武汉大学公共卫生学院

通信作者及单位：刘晓俊，宜昌市疾病预防控制中心；江琦，武汉大学公共卫生学院

Whole-genome sequencing to characterize the genetic structure and transmission risk of Mycobacterium tuberculosis in Yichang city of China.

Ji L, Tao FX, Yu YF, Liu JH, Yu FH, Bai CL, Wan ZY, Yang XB, Ma J, Zhou P, Niu Z, Zhou P, Xiang H, Chen M, Xiang Z, Zhang FQ, Jiang Q, Liu XJ.

Front Public Health，2023，10:1047965.

doi: 10.3389/fpubh.2022.1047965.

PMID: 36699912. 

研究背景

感染结核分枝杆菌发展为结核病主要是通过最近的传播事件和体内潜在的结核病再激活这两种机制。分子流行病学研究显示，由结核分枝杆菌菌株的传播导致的结核病可能占结核病患者的35%～40%，甚至高达70%。尤其是在耐多药结核病（MDR-TB）中，越来越多的证据表明耐药结核分枝杆菌菌株的传播是发生结核病的重要驱动因素。针对结核分枝杆菌的传播问题，既往研究多集中在上海、深圳等经济发达地区，两地分别有73%和25.2%的MDR-TB患者可能存在耐多药菌株的传播。而经济不发达且卫生资源欠缺的农村地区，作为结核病的高发地，关于MDR-TB传播的相关研究却较少。本文旨在研究农村地区结核病的传播，以及分析影响其传播的相关危险因素。

研究方法

一、样本纳入

宜昌市是湖北省第三大地级市，土地面积2.1万 km2，常住人口400万人。从所辖的5个区和8个县中，我们选择了宜都和秭归两个具有代表性的县市来研究农村地区流行结核病的分子流行病学。研究区域涵盖人口69.2 万人，分别占宜昌地区总人口的17.22%和29.68%。

2018—2020年，宜昌市共有1981例活动性肺结核患者，其中42.3%（838/1981）的患者通过细菌学检查确诊。一般来说，涂片阳性患者和高度怀疑有耐药性的患者将接受药物敏感性测试。总共有45例患者被诊断并登记为MDR-TB，占细菌阳性患者的5.37%。这些县的MDR-TB检出率相对较低，宜都和秭归的细菌阳性结核病比例分别为2.85%（7/246）和1.47%（6/408）。将阳性培养物中的临床菌株进行全基因组测序及检测全部耐药谱。研究共收集了161例患者的231株菌株，占研究期间两个县细菌阳性患者的24.62%（161/654）。

入选患者的基本人口学特征和临床信息均来自国家结核病登记系统，包括患者的性别、年龄、国籍、职业、居住地址和结核病治疗史等。

二、全基因组测序与分析

培养阳性的菌株利用CTAB法提取菌株基因组DNA，建立300 bp双端测序文库，在Illumina 2500 平台上进行全基因组测序。利用前期研究建立的网络分析平台SAM-TB（http://samtb.szmbzx.com）进行测序数据分析、鉴定结核分枝杆菌亚型、区分非结核分枝杆菌、预测各菌株对14种抗结核药物的耐药谱，再利用tb-profil-er工具进行验证。利用最大似然法建立系统发育树，并使用iTOL（https://itol.e-mbl.de/）进行可视化。同时计算两两菌株的遗传距离，成对遗传距离<12个单核苷酸多态性（SNP）的分离株被认为是传播簇。

三、流行病学调查

对基因组成簇的患者进一步进行流行病学调查，由社区医生询问其是否认识同一基因簇内的其他患者，核实居住地址、工作场所，并补充可能接触传播的场所与人员信息，为构建传播链提供社会联系资料，以发现结核病传播发生的接触关系或高危场所。

研究结果

一、研究样本纳入及其基本特征描述

从2018年7月1日至2020年12月31日，宜都和秭归共有654例患者被诊断为细菌阳性肺结核，报告发病率为37.8/100 000。将痰培养阳性的231份标本进行全基因组测序。排除来自同一患者的47株重复菌株，获得184株代表性菌株，排除18株非结核分枝杆菌、4株其他种、1株未能测序菌株后，对161株结核分枝杆菌临床菌株及其临床数据进行分子特征分析，患者纳入流程图见图1。所有患者和测序患者的人口统计学特征见表1。共有24.62%（161/654）的患者培养阳性，并对其临床菌株成功测序。

161例患者中，75例（43.2%）来自秭归，83例（54.1%）来自宜都，另3例生活在城市其他地区；男性患者占74.5%（120/161），中位年龄（四分位数）为62（50，71）岁；农民占68.3%（110/161）。秭归的农民数量明显高于宜都（88%和53%）。患者的中位诊断延迟时间为23（12.0，47.5）d。大多数患者（77.6%，125/161）为涂片阳性；13.7%（22/161）为复发患者。

图1   患者纳入流程图

表1 纳入患者的基本特征统计

二、流行的结核分枝杆菌的遗传结构与耐药特征

对161株宜昌地区流行的结核分枝杆菌的全基因组序列构建系统进化树（图2）。大部分（57.1%，92/161）为2型结核分枝杆菌，即北京型菌株，其中71株为现代北京亚型；另69株（42.9%，69/161）均为4型菌株，为欧美型菌株（euro-american lineage），包括11株L4.2亚型、2株L4.3亚型、19株L4.4亚型及37株L4.5亚型结核分枝杆菌。

利用TB-profiler与SAM-TB对各菌株鉴定已知的与抗结核药物耐药相关的基因突变，预测其耐药谱（图2） 。共49株菌株被检测出耐药相关基因突变，任意耐药率为30.4%（49/161），其中仅6株为MDR-TB，耐多药率为3.7%（6/161），但是非耐多药的利福平耐药结核病（Rr-TB）与异烟肼耐药结核病（Hr-TB）分别有11株与13株，占全部阳性菌株的6.8%与8.1%。值得注意的是，共有14株菌株对二线氟喹诺酮类药物（FQ）耐药，包括5株MDR-TB、1株Rr-TB、1株Hr-TB和7株单耐药菌株。在全部患者中，FQ总耐药率为8.7%（14/161），而MDR-TB中FQ耐药率高达5/6。

图2  宜昌市161株临床结核分枝杆菌的系统进化树及耐药谱分布

总体而言，不同药物的耐药率从高到低依次为链霉素[Sm，23（14.3%）]、异烟肼[INH, 19（11.8%）]、利福平[RFP, 17（10.6%）]、FQ药物[14（8.7%）]、乙硫异烟胺[Eto, 7（4.3%）]、对氨基水杨酸[PAS, 6（3.7%）]、吡嗪酰胺[PZA, 6 （3.7%）]、乙胺丁醇[EMB, 4（2.5%）]、氨基糖苷类药物[AG, 2（1.2%）]、环丝氨酸[Cs, 1（0.6%）]。未发现对其他二线A类药物的耐药菌株。北京型菌株的耐药率明显高于欧美型菌株，任意耐药率分别为40.2%（37/92）与17.4%（12/69），各类药物的耐药率也均高于欧美型菌株（补充表1） 。古老北京亚型菌株更容易出现单耐RFP菌株，占该亚型菌株的33.3%（7/21）。

三、耐药谱分布及相关影响因素

161株菌株对应的患者中复治患者占13.7%（22/161），大部分复治患者（54.5%）诊断延迟的时间在2周以内，而大部分初治患者（57%）的诊断延迟时间在4周以内。与初治患者相比（77.3%），在本地登记治疗且治疗成功的复治患者仅占45.5%（补充表2）。复治患者的耐药率明显高于初治患者，任意耐药率分别为40.9%（9/22）与28.8%（40/139）；并且在耐多药患者中，复治患者的比例高达4/6。值得注意的是，除EMB、PZA及AG之外，复治患者也更容易在RFP和FQ中发生耐药（表2）。

表2  初、复治患者的耐药谱比较

同时在对菌株耐药突变基因的检测中，我们发现FQ耐药菌株中均发生了gyrA基因突变，其中78.6%的菌株基因突变位点发生在D94G和A90V；INH的耐药菌株中大部分（73.7%）发生了katG基因突变，少数发生了fabG1基因突变；而RFP耐药菌株中均是rpoB基因发生了突变。

四、结核分枝杆菌基因组遗传距离与成簇分析

为分析研究地区结核病的传播特征，对两两菌株的全基因组序列进行比较，计算遗传距离。以12-SNP为阈值鉴定传播簇时，共50株菌株被分为23个传播簇，基因组成簇率为31.1%（50/161）。

结核分枝杆菌基因组成簇代表其患者在研究期间具有传播关联，为分析更容易发生传播的结核分枝杆菌特征，我们比较了成簇菌株与非成簇菌株的人口学和病原学特征（表3）。结果显示，在不同的年龄段中，45岁及以下患者的菌株更容易成簇；宜都地区的成簇率明显高于秭归地区（44.6%和14.7%）；诊断延迟时间在4～8周患者的菌株成簇的概率最高（50%）；所有的成簇患者中83.7%的患者最终都有成功的治疗结局。不同菌型或耐药类型的结核分枝杆菌中，成簇率差异均无统计学意义（补充表3）。值得注意的是，成簇菌株中RFP耐药率略高于非成簇菌株（14.0%和9.0%）。

表3  菌株基因组成簇与非成簇患者的人口学与病原学特征比较

利用逻辑回归计算各因素增加结核病近期传播风险的校正比值比（adjusted odds ratio, aOR），如表4。在校正结核分枝杆菌菌型与利福平耐药特征的单因素逻辑回归模型中，45岁及以下的患者更容易感染成簇菌株，其传播风险较45岁以上的患者高3.46 （1.45～8.26） 倍；初治患者的菌株基因组成簇的风险是复治患者的4.09（1.08～15.45）倍；诊断延迟>4周时，传播风险增加2.63 （1.31～5.30）倍；而宜都地区患者临床菌株的成簇率[44.6%（37/83）]明显高于秭归县[14.7%（11/75）] ；欧美型菌株的成簇率（39.1%）高于北京型菌株的成簇率（25.0%）。以上相关因素纳入多因素逻辑回归模型中，结果发现与结核病近期传播独立相关的危险因素[aOR（95%CI）]包括年龄≤45岁[3.46（1.28～9.35）]、初治患者[6.14（1.39～27.07）]、宜都地区[6.45（2.37～17.54）]、欧美型菌株[2.22（1.00～4.91）]的患者，而RFP耐药菌株没有显著的传播优势。

表4  结核分枝杆菌基因组成簇的风险因素分层多因素逻辑回归

五、传播簇患者的空间与关联分析

将成簇患者的居住地址连接起来，并计算居住距离，分布如图3所示。同一县的大多数成簇患者居住在32 km以内。发现6对成簇患者居住在距离超过60 km的不同县。如果将2 km范围视为同一社区，则50例成簇患者中只有2对（8%，4/50）生活在同一社区。

图3 传播簇患者的空间与社会关联

对成簇患者的流行病学调查发现，只有两个簇中存在已确认的流行病学联系。一组中的2例患者彼此不认识，但住在同一条街上，地理距离在2 km以内；前一例患者于2019年10月出现临床症状，1个月后被诊断为结核病；后者出现症状，1年后被诊断为结核病。另一组的2例患者彼此认识，住在同一个村庄，经常一起参加村庄的婚礼和葬礼。他们出现临床症状的时间大约有3个月的间隔，而结核病的诊断是在同一个月。

研究结论

宜昌地区结核病的耐药情况较为严重，尤其是对二线药物FQ的耐药。患者的规范性治疗与临床FQ用药应引起注意。同时，结核分枝杆菌近期传播风险较高，需加强基层的快速诊断与治疗管理。

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供稿：纪    律

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2023-02-03