作者解读丨贵大/藏大/广西农科院等: 内生枯草芽孢杆菌菌株GUCC4对百香果的生长促进作用及对黑孢菌叶枯病的生物防治(国人佳作)

编译：微科盟君影，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

百香果(Passiflora edulis Sims)广泛种植于热带和亚热带地区，用于食用水果、观赏园艺、化妆品的生产以及药理应用。其较高的经济、营养和药用价值引发了市场需求的日益增长，种植面积迅速增加。由黑孢菌Nigrospora sphaerica引起的叶枯病是中国西南部贵州省一种新出现的百香果病害，该地区独特的喀斯特山地景观和气候条件被认为是百香果产业的潜力拓展区域。芽孢杆菌(Bacillus spp.)是农业系统中最常见的生物防治和植物促生菌(PGPB)资源。然而，目前对百香果叶际中Bacillus spp.的内生存在及其作为生物防治和PGPB资源的研究较少。本研究从中国广西15个健康的百香果叶片中分离到44株内生细菌。通过纯化和分子鉴定，其中42个菌株属于芽孢杆菌。通过体外试验测定了它们对黑孢菌N. sphaerica的抑菌活性。其中11个内生芽孢杆菌菌株对N. sphaerica的抑菌率大于65%。它们都能够产生与生物防治和植物生长促进相关的代谢物，包括吲哚-3-乙酸(IAA)、蛋白酶、纤维素酶、磷酸酶和可溶性磷酸盐。此外，在百香果幼苗上测试了上述11个内生Bacillusspp.菌株的植物生长促进特性，发现其中一株枯草芽孢杆菌(B. subtilis)菌株GUCC4显著增加了百香果的茎粗、株高、叶长、叶面积、鲜重和干重。此外，B. subtilis GUCC4显著降低了植株脯氨酸含量，表明其可能积极调控百香果的生化特性，进而促进植株生长。最后，在温室条件下测定了B. subtilis GUCC4对N. sphaerica的体内生物防治效果。与杀菌剂代森锰锌和一种基于B. subtilis的商业生物农药类似，B. subtilis GUCC4 显著降低了病害的严重程度。以上结果表明，B. subtilis GUCC4在百香果黑孢菌叶枯病生物防治和植物促生领域具有很大的潜力。  

论文ID

原名：Plant Growth Promotion and Biocontrol of Leaf Blight Caused by Nigrospora sphaerica on Passion Fruit by Endophytic Bacillus subtilis Strain GUCC4

译名：内生枯草芽孢杆菌菌株GUCC4对百香果的生长促进作用及对黑孢菌叶枯病的生物防治

期刊：Journal of Fungi

IF：5.724 (中科院生物学大类2区)

发表时间：2023.01.18

作者：王俊容、秦顺、樊瑞冬、彭强、胡小京、杨柳、刘增亮、Ivan Baccelli、Quirico Migheli, Gabriele Berg

通讯作者：陈孝玉龙，Tomislav Cernava

通讯作者单位：贵州大学/西藏大学/奥地利格拉茨技术大学

DOI号：10.3390/jof9020132

实验设计

结果

1 内生细菌的鉴定及对N. sphaerica拮抗作用的筛选

共从15个百香果叶片中分离到42株内生芽孢杆菌(Bacillus)样细菌。通过16S rRNA基因测序的方法对菌株进行鉴定，27个菌株被鉴定为B. cereus，3个菌株为B. anthracis，2个菌株为B. subtilis，2个菌株为B. altitudinis，2个菌株为B. wiedmanni，2个菌株为B. thuringiensis，1个菌株为B. pumilus，3个菌株为Bacillus sp.，2个菌株为Agrobacterium tumefaciens(表1)。在42个芽孢杆菌菌株对N. sphaerica的抑菌活性的共培养试验中，抑菌率在0.00%至75.35%之间(表1)。其中11个菌株的抑菌率均在65%以上，分别为GUCC8(B. subtilis)、GUCC4(B. subtilis)、GUCC9(B. cereus)、GUCC7(B. cereus)、GUCC1001(B. cereus)、GUCC11(B. cereus)、GUCC6(B. cereus)、GUCC2(B. cereus)、GUCC5(B. cereus)、GUCC10(B. cereus)和GUCC3(B. cereus)(图1)，其抑菌率分别为75.35%、71.16%、69.21%、69.84%、69.46%、68.82%、67.55%、68.74%、68.99%、69.04和69.53%。

表1 基于16S rRNA测序的方法鉴定从百香果叶片中分离的内生细菌及其对N. sphaerica的抑菌率

注：数据表示平均值±标准偏差。同一列中的不同字母表示统计显著性(p<0.05)

图1 

与对照、合成杀菌剂代森锰锌和参考菌株B. subtilis NCD_2相比，11个芽孢杆菌菌株对N. sphaerica的抑制作用。(ck)：对照，(a)：代森锰锌，(b)：B. subtilis NCD_2，(c)：B. subtilis GUCC8，(d)：B. subtilis GUCC4，(e)：B. cereus GUCC7，(f)：B. cereus GUCC3，(g)：B. cereus GUCC6，(h)：B. cereus GUCC9，(i)：B. cereus GUCC11，(j)：B. cereus GUCC2，(k)：B. cereus GUCC5，(l)：B. cereus GUCC1001，(m)：B. cereus GUCC10。

2 潜在Bacillus菌株的系统发育分析

除GUCC1001、GUCC2、GUCC3、GUCC4、GUCC5、GUCC6、GUCC7、GUCC8、GUCC9、GUCC10和GUCC11的16S rRNA基因序列外(表1)，对其gyrB基因的PCR扩增产物进行测序，并将序列提交到GenBank数据库(登录号分别为：ON908211、ON908201、ON908202、ON908203、ON908204、ON908205、ON908206、ON908207、ON908208、ON908209和ON908210)。对11个潜在Bacillus菌株进行了系统发育分析，并分别基于16S rRNA基因和gyrB基因序列构建了系统发育树(图2)。结果显示，与标准菌株的序列相比，菌株GUCC1001、GUCC2、GUCC3、GUCC5、GUCC6、GUCC7、GUCC9、GUCC10和GUCC11属于B. cereus类群。菌株GUCC4和GUCC8属于B. subtilis类群。

图2 基于16S rRNA(A)基因和gyrB(B)基因序列的系统发育树。其中加粗的菌株为本研究中的菌株。

3 Bacillus菌株挥发性化合物和培养滤液对N. sphaerica的抑制活性

菌株GUCC8(B. subtilis)、GUCC7(B. cereus)、GUCC5(B. cereus)、GUCC10(B. cereus)、GUCC2(B. cereus)、GUCC11(B. cereus)、GUCC6(B. cereus)释放的挥发性化合物对N. sphaerica的生长显示出抑制作用(图3A)。此外，11个潜在拮抗菌株的培养滤液均表现出对N. sphaerica菌丝生长的抑制作用(图3B)。抑菌率的范围为8.55%至19.14%(图3C)。

图3 

(A) 11个Bacillus菌株挥发性化合物对N. sphaerica的抑制作用，ck：对照；a：B. subtilis GUCC8；b：B. subtilis GUCC4；c：B. cereus GUCC7；d：B. cereus GUCC3；e：B. cereus GUCC6，f：B. cereus GUCC9，g：B. cereus GUCC11，h：B. cereus GUCC2，i：B. cereus GUCC5，j：B. cereus GUCC1001，k：B. cereus GUCC10。(B) 11个Bacillus菌株的培养滤液对N. sphaerica的抑制作用，a：B. subtilis GUCC8；b：B. subtilis GUCC4；c：B. cereus GUCC7；d：B. cereus GUCC3；e：B. cereus GUCC6，f：B. cereus GUCC9，g：B. cereus GUCC11，h：B. cereus GUCC2，i：B. cereus GUCC5，j：B. cereus GUCC1001，k：B. cereus GUCC10。(C) 11个Bacillus菌株的培养滤液对N. sphaerica的抑制率。数据以平均值±标准偏差表示，同一列不同字母表示统计显著性(p<0.05)。

4 次生代谢产物的体外筛选

如表2所示，除B. cereus GUCC7外，其余所有候选菌株合成的IAA含量均在2.278~5.044 µg/mL之间。同时，11个菌株均能产生淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶。此外，只有B. subtilis GUCC4和B. subtilis GUCC8显示出溶磷活性。

表2 本研究中内生Bacillius spp.产生的次级代谢产物的体外筛选

注：+：能够分泌这种酶；−：没有分泌这种酶的能力。表中数据以平均值±标准偏差表示。同一列不同字母表示统计显著性(p<0.05)

5 内生Bacillus菌株对温室植物生长的促进作用

在温室条件下，B. cereus GUCC3和B. subtilis GUCC4显著增加了百香果的株高、茎粗、叶长、叶面积、鲜重和干重等生物量组分(表3)。相比之下，B. cereus GUCC6对百香果的生长未表现出显著的促进作用。此外，其余8个菌株均表现出菌株-生物量之间的特异性效应。例如，B. cereus GUCC8显著增加了植株的株高、茎粗、叶长和叶面积，但它不能增加百香果植株的鲜重和干重。

11个潜在菌株对植株生理生化特性的影响具有极强的菌株特异性(图4)。没有一个菌株能对所有测定的指标产生积极影响，包括叶绿素含量(SPAD值)；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性；以及丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)的含量。具体而言，B. subtilis GUCC4、B. cereus GUCC11、B. cereus GUCC5、B. cereus GUCC1001、B. cereus GUCC10、B. cereus GUCC2、B. cereus GUCC6、B. cereus GUCC9和B. subtilis GUCC8处理均显著提高了百香果叶片的叶绿素含量(SPAD值)。B. cereus GUCC1001和B. cereus GUCC2显著增加了SOD活性，B. cereus GUCC5和B. cereus GUCC3显著增加了POD活性。此外，B. cereus GUCC11、B. cereus GUCC5、B. cereus GUCC1001、B. cereus GUCC7、B. cereus GUCC10、B. cereus GUCC2和B. cereus GUCC 8显著增加了CAT活性。此外，B. cereus GUCC11和B. subtilis GUCC8显著降低了MDA含量。同时，B. cereus GUCC11、B. cereus GUCC5、B. cereus GUCC10、B. cereus GUCC2、B. cereus GUCC6、B. cereus GUCC9和B. subtilis GUCC4显著降低了脯氨酸含量。

表3 内生Bacillus菌株对百香果幼苗生长参数的影响

注：表中的数据表示平均值±标准偏差。同一列不同字母表示统计显著性(p<0.05)

图 4 不同 Bacillus 菌株对百香果叶片总叶绿素含量 

(A) 、 SOD(B) 、 POD(C) 、 CAT(D) 酶活性、总 MDA(E) 和 Pro 含量 (F) 的影响。数据表示三个生物重复的平均值 ± 标准偏，同一列不同字母表示统计显著性 ( p <0.05) 。

6 B. subtilis GUCC4对温室中叶枯病的生物防治作用

在移栽后28天测定百香果叶片的发病率。B. subtilis GUCC4、代森锰锌和B. subtilis NCD_2处理的幼苗的发病率分别为42.76%、37.39%和52.72%，对照的发病率为75.45%(表4)。与接种对照相比，B. subtilis GUCC4、代森锰锌和B. subtilis NCD_2处理对植株的保护率分别为43.33%、50.44%和30.12%(表4)。

表4 温室条件下B. subtilis GUCC4菌株对百香果N. sphaerica引起叶枯病的生物防治

注：/代表无数值；**/***代表显著性差异

讨论

百香果是一种重要的木本植物，具有很高的经济、营养和药用价值。在过去十年中，其市场需求在全球范围内持续增长，包括在中国。然而，百香果的栽培和生产受到了生物胁迫的挑战，如害虫和植物病原，特别是在包括山区在内的低温地区。同时，寒冷和营养限制等非生物胁迫也会对其生长产生负面影响。

植物内生细菌，包括芽孢杆菌(Bacillus spp.)可以通过各种代谢活动直接或间接地促进植物生长，包括通过诱导系统性抗性来激活宿主防御，直接抑制病原体或与病原体竞争。一般来说，黑孢菌(Nigrosopra spp.)被认为是植物内生菌。近年来，N. sphaerica被报道为百香果等不同植物叶枯病的致病菌。迄今为止，包括潜在生物防治资源在内的可持续管理战略在很大程度上仍未被应用于黑孢菌引起的叶枯病绿色防控。此外，人们对百香果内生生境中芽孢杆菌Bacillus spp.的多样性、生物防治和PGP潜力还知之甚少。

本研究从健康的百香果叶片中鉴定出一系列对宿主有益的内生芽孢杆菌。从健康百香果叶片中分离的11个菌株在体外对百香果叶枯病病原菌N. sphaerica表现出有效的拮抗作用。通过16S rRNA基因序列同源性分析对菌株进行了鉴定。菌株GUCC2、GUCC3、GUCC5、GUCC6、GUCC7、GUCC9、GUCC10、GUCC11和GUCC1001被鉴定为蜡样芽孢杆菌B. cereus，GUCC4和GUCC8被鉴定为枯草芽孢杆菌B. subtilis。该鉴定结果与通过gyrB基因序列同源性分析鉴定到的结果一致。此外，我们发现B. subtilis GUCC8、B. cereus GUCC7、B. cereus GUCC5、B. cereus GUCC10、B. cereus GUCC2、B. cereus GUCC11和B. cereus GUCC6的挥发性物质可以抑制N. sphaerica菌丝的生长。这些结果与前人的研究一致，即Bacillus可以释放具有抗真菌特性的挥发性有机化合物，包括苯化合物、芳香烃、酮、醛、烷基、硫化物、吡嗪和醇类。

为了进一步研究上述内生菌株的PGP和生物防治潜力，本研究测定了它们的IAA生产能力、溶磷能力和各种酶活性(蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶)。结果显示它们都能产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶。除B. cereus GUCC7外，其它菌株均能合成IAA。然而，只有B. subtilis GUCC4和B. subtilis GUCC8显示出溶磷活性。Vassilev等人报道称，微生物活性对不溶性磷酸盐的增溶通常会诱导某些代谢产物的分泌，主要是铁载体、水解酶和植物激素，这些代谢产物与抑制植物病原体有关。有研究发现，拮抗性Pseudomonas aeruginosa Rh323的促生长活性与铁载体的产生和磷酸盐的增溶有关。此外，P. aeruginosa BRp3的促生长活性可能与IAA的产生伴随的增磷作用有关。据Gandhi等人报道，Chryseobacterium aquaticum PUPC1的水稻根际缔合物产生抗真菌蛋白酶，对菌丝生长、孢子萌发和植物病原真菌的成核具有抑制作用。之前的研究表明，B. subtilis的淀粉水解能力可以帮助宿主植物利用复杂的碳源，增强对植物病原体等生物胁迫的抗性。

此外，我们评估了这些候选菌株在温室条件下的PGP活性，发现B. cereus GUCC3和B. subtilis GUCC4显著增加了百香果的所有生物量组分，包括株高、茎粗、叶长、叶面积、鲜重和干重。我们的发现与之前的研究类似，例如，Hashem等人报道了B. subtilis BERA71具有促进植物生长的作用(在根长、茎粗、鲜重和干重方面)。同样，从玉米和桉树中分离出的B. cereus菌株在作用于植物时也能促进玉米和桉树的生长发育。然而，由于B. cereus目前被认为是一种潜在的人类病原体，我们的研究排除了B. cereus GUCC3，以进一步评估其体内生物防治缺陷。

芽孢杆菌属的植物促生细菌PGPB因其在植物病原体生物防治中的双重作用而被广泛研究。它们通常通过诱导生长素、糖苷和其他代谢产物的产生来促进植物生长，增强植物的营养能力，并通过各种机制保护植物免受生物和非生物胁迫。本研究测定了内生B. subtilis GUCC4在温室中防治百香果黑孢菌N. sphaerica的生物防治效率，并与化学合成杀菌剂代森锰锌进行了比较，据报道该杀菌剂对N. sphaerica有抑制活性。此外，将商业生物杀菌剂中的B. subtilis NCD_2用作对照菌株。对照组的发病率为75.45%。B. subtilis GUCC4、代森锰锌和B. subtilis NCD_2在降低发病率方面均表现出显著效果。其保护率分别为43.33%、50.44%和30.12%。这些发现与先前在其他植物上的报道一致，即枯草芽孢杆菌B. subtilis菌株可以显著降低不同植物叶片病害的发病率，包括病原真菌引起的叶枯病。有趣的是，B. subtilis GUCC4、代森锰锌和B. subtilis NCD_2之间没有显著差异。

换言之，本试验中筛选出的GUCC4菌株表现出与商业化学杀菌剂和商品化生物农药相似和可替代的性能。这与其它B. subtilis菌株不同，诸多研究中发现与化学合成杀菌剂相比，B. subtilis往往对同一宿主上的同一病原防治效力低于化学农药。因此，B. subtilis GUCC4除了在促进百香果幼苗生长方面具有显著作用外，还具有进一步应用于百香果黑孢菌叶枯病生物防治的潜力。在未来应进行进一步的大田应用研究，以评估其作为生物杀菌剂和生物肥料开发的潜力，特别是用于百香果产业。

此外，关于叶内生菌与百香果之间相互作用关系值得进一步深入细致探究，如：B. subtilis GUCC4在百香果促生和生物防治上的精确机制，以及其对叶际微生物组的调控，诱导抗病/抗胁迫基因的能力，以及是否存在新的次级代谢产物产生等，都需要进一步阐明。