精准前沿丨通过粪便靶向测序快速诊断结核病耐药性

本期《精准前沿》栏目分享美国贝勒医学院Mandalakas A研究团队发表于Genome Medicine（IF=15.266）上的一篇研究[1]，研究利用靶向新一代测序（tNGS，Deeplex® Myc-TB），对粪便标本进行全面的结核分枝杆菌复合物耐药性测试，同时分析了来自两个队列的样本，以确定粪便tNGS的快速分子耐药测试（mDST）和痰液的表型药敏测试（pDST）之间的一致性。

研究背景

2019年，估计的1000万结核病患者中，只有710万（71%）获得了治疗。HIV感染者、儿童和耐药结核病患者的病例检出率存在较大差距。耐多药（MDR）结核病（至少对异烟肼和利福平耐药）目前占全球新发结核病病例的3.3%，占既往治疗病例的18%，并且在检测到的结核病病例中所占比例继续上升。迫切需要快速、全面地检测结核分枝杆菌复合菌株的耐药性，以指导适当的治疗方案。早期识别耐多药结核病患者、mDST以及与护理的联系对于减少耐多药结核分枝杆菌复合菌株的传播至关重要。

由于幼儿和艾滋病毒感染者往往无法提供痰液样本，因此需要诱导痰或胃抽吸等操作来采集肺结核的诊断标本。越来越多的证据表明，结核分枝杆菌可以在结核病患者的粪便中发现。通过聚合酶链反应（PCR）鉴定粪便标本中的结核分枝杆菌复合体，通常使用GeneXpert MTB/RIF（Xpert®），已证明对儿童和成人呼吸道标本培养的敏感性为60%-70%。相比之下，结核分枝杆菌复合菌株粪便培养对呼吸道培养的敏感性低于30%，限制了粪便标本pDST表型药物敏感性检测的效用。因此，迫切需要基于粪便标本的可靠耐药性预测方法。

研究设计

队列一

2014年至2019年期间，从姆巴巴纳政府医院、姆巴巴内的贝勒儿童基金会诊所和曼齐尼的罗利-菲特金纪念医院的结核病诊所招募了门诊患者，包括儿童和成人结核病患者。每位受试者提供了两个痰标本。其中一项由Xpert MTB/RIF（2014-2019）或Xpert Ultra（2019）根据制造商说明进行了测试。第二个标本用于斯威士兰姆巴巴内的国家结核病研究实验室（NTRL）的培养。根据制造商的说明，使用分枝杆菌生长指示管（MGIT）960系统（用于培养分枝杆菌的液体培养基）进行痰培养。使用MGIT系统对异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、链霉素、乙胺丁醇以及有指征的氟喹诺酮类药物，阿米卡星和卷曲霉素进行表型DST。

队列二

2018 年至 2019 年间在德国博斯特尔研究中心的医学诊所前瞻性地收集了培养确诊肺结核成年患者的粪便和痰液样本。每位参与者在入院接受结核病治疗的同一天提供了两个痰样本和一个粪便样本。对标本进行抗酸杆菌染色，并通过显微镜和Xpert Ultra分析是否存在结核分枝杆菌复合物DNA，如果尚未在转诊医院进行。除了异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的表型DST外，还进行了固体培养和液体培养（MGIT）。在对异烟肼和利福平耐药的情况下，对左氧氟沙星和莫西沙星、贝达喹啉、利奈唑胺、氯法齐明、环丝氨酸/特利西酮、德拉马尼、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、PAS和丙硫酰胺（噻虫酰胺的代表）进行了全面的二线pDST。在MGIT中进行二线DST，并根据WHO的临界浓度进行解读。对于环丝氨酸，pDST在固体培养基上使用30mg / L的临界浓度进行。

tNGS分析

Deeplex®Myc TB检测靶向18个耐药相关基因（rpoB、ahpC、fabG1、katG、inhA、pncA、embB、gyrA、gyrB、rrs、eis、tlyA、gidB rpsL、ethA、rv0678、rrl、rplC）的全序列（即编码序列加部分启动子区）或最相关区域，结合基因组靶标进行分枝杆菌种类鉴定（hsp65）和结核分枝杆菌复合菌株基因分型（CRISPR基因座）。按照制造商的指示进行Deeplex®Myc TB扩增（使用单个Master Mix进行24丛PCR）后，使用Nextera XT试剂盒制备扩增子库，并使用NextSeq 500仪器（Illumina，San Diego，California，USA）对150 bp的成对末端读数进行测序。使用Deeplex®Myc TB web应用程序中实现的集成生物信息学管道v1.3进行分析。

使用Bowtie 2将NGS读数自动映射到结核分枝杆菌H37Rv参考序列上，并根据覆盖深度以3%的读数比例限制变体。然后根据目标覆盖范围的宽度对样本进行分类，并按质量分类为ND， − , + , +  + , 或 +  +  +。通过使用精心策划的ReSeqTB数据库与综合参考变异进行比较，检测到的变异与耐药性或易感性或系统发育谱系关联。当数据库中未包含变异时，突变被定义为未特征化。此外，hsp65基因的401bp片段被用作分枝杆菌物种鉴定的主要参考，MTBC菌株孢子型鉴定的直接重复区，以及控制PCR抑制的内部控制序列。

研究结果

1.  队列研究

队列一包括66例诊断为结核病的患者（图1A）。56名受试者和10名受试者没有通过qPCR在粪便中检测到结核分枝杆菌复合物DNA。大多数确诊为结核病（96%），其中83%通过Xpert确诊，73%通过呼吸道标本MGIT培养确诊，85%通过粪便qPCR确诊。在粪便qPCR阳性的参与者中，10/56（18%）的浓度为>100飞克/微升（fg/μl）（约2316 CFU的结核分枝杆菌），25/56（45%）在1至100 fg/μl之间，21/56（37%）的结核分枝杆菌DNA浓度<1 fg/μl（约63 CFU的结核分枝杆菌））

队列二的所有21名受试者均为HIV阴性成人，患有培养确诊的结核病，主要是男性（90%），中位年龄为30岁（IQR 22-39）。Xpert Ultra在86%的患者痰液中检测到结核分枝杆菌复合物DNA（16例阳性和2例痕量）。在粪便qPCR呈阳性的16名德国参与者中，2名（13%）的浓度>100 fg/μl，7名（44%）的浓度在1至100 fg/μl之间，7名（44%）的结核分枝杆菌DNA浓度<1 fg/μl（图1B）。

图1. 队列一和队列二的研究流程

2.  tNGS的性能

在队列一中（图1A），在粪便定量qPCR呈阴性的10个样本中，9个样本的tNGS结果为阴性，1个样本为阳性。总的来说，tNGS在38/56（68%）的结核分枝杆菌复合物qPCR阳性样本中检测到结核分枝杆菌的复合物DNA。在38份tNGS结果的样本中，28份（74%）的读数足以预测多达13种抗结核药物的耐药性。

tNGS耐药预测存在浓度依赖关系；粪便qPCR浓度分别为7/10（70%）、18/25（72%）和3/21（14%）的样本 > 100 fg/μl、1-100 fg/μl/ 和< 1 fg/μl，分别产生耐药报告（p = 0.0004）。逻辑回归模型证实了这一点，该模型证明了结核分枝杆菌DNA浓度的增加与成功的tNGS耐药性预测之间的强烈关联。tNGS结果的质量随着结核分枝杆菌DNA浓度的增加而增加，在在qPCR浓度为 > 100fg/μl中平均覆盖深度中值为2866.1，在qPCR浓度为1–100 fg/μl的样品中平均覆盖深度中值为1298.4，在qPCR浓度小于1 fg/μl的样品中平均覆盖深度中值为51.1。

在队列二（图1B）中，tNGS检测到结核分枝杆菌复合物DNA，并在结核分枝杆菌复合体qPCR阳性的12/16（75%）样本中产生耐药性报告；粪便qPCR结核分枝杆菌DNA浓度为分别为 > 100 fg/μl、1–100 fg/µl和 < 1 fg/μl（p = 0.02）。

3.  耐药性分析

队列一

粪便中的tNGS-mDST结果与痰中的pDST结果配对，具有高度一致性（k = 0.82）（图 2A）。在18个具有异烟肼和乙胺丁醇配对mDST和pDST结果的样本中，一致性基本达到几乎完美（分别为k = 0.73和k =1 ）。在Xpert或pDST检测到一线耐药性的受试者中，氟喹诺酮类药物、阿米卡星和卷曲霉素的二线pDST结果在三名受试者中可用，并且与粪便的mDST结果一致。

在具有足够测序质量的队列一（图2A）的28个样本中，六个（21%）被归类为多重耐药，其中四个携带rpoB I491F突变。根据氟喹诺酮类耐药突变和rv0678突变的鉴定，1份样本被归类为广泛耐药；后一种突变已被定义为贝达喹啉和氯法齐明耐药的标志。该患者的pDST和粪便mDST也显示出氟喹诺酮类药物耐药性。此外，另外三个具有rpoB I491F突变的样品也具有rv0678突变，因此很可能对贝达喹啉和氯法齐明耐药。

在18个具有利福平耐药性的分子和表型配对结果的标本中，有两个标本对两种方法都有耐药性，包括一个被确认为rpoB I491F突变的标本。然而，另外两个通过mDST鉴定为rpoB I491F突变的标本通过pDST检测是易感的。其余14份标本两种方法都是易感的。在利福平耐药性方面，mDST和pDST的总体一致性很高（k = 0.61）。值得注意的是，所有具有rpoB I491F突变的标本也具有rv0678 M146T突变，该突变可赋予贝达喹啉和氯法齐明抗性。

队列二

在21个粪便标本中，有11个（52%）的粪便mDST结果可完全解释为耐药性，另有一个样本（B1）可部分解释（图2B）。基于粪便的mDST与痰液pDST之间的一致性很高（k = 0.84）。在这12个样本中，有6个（50%）被粪便中的mDST归类为利福平耐药，一个样本的rpoB L430P发生了未知突变，而pDST显示为耐药。

在6个具有利福平耐药性的样本中，有2个显示了额外的耐药性：其中一个根据氟喹诺酮耐药性突变的鉴定被归类为前XDR-TB，另一个由于氟喹诺酮耐药性介导突变gyrA D94G和贝达喹啉耐药性介导突变rv0678的组合被定义为XDR-TB。对这些参与者进行的pDST证实了基因型预测的耐药性。对于氯法齐明，粪便中的mDST发现了rv0678 G65E突变，但相应的痰液标本被pDST确定为易感（B12）。然而，这个突变被标记为具有最低置信度的突变，并且也以6%的低频率被调用。

图2. Deeplex®Myc TB耐药类型和pDST耐药检测

4.  混合感染

tNGS检测还产生了混合感染（如与两个结核病复合菌株）、异抗、spoligotype和系统发育系分类的数据。在队列一中，有四名参与者被发现有混合感染（一个通过物种鉴定，三个通过系谱特异性SNP分析），通过物种鉴定匹配发现的少数人群占总数的8%。在一名耐多药结核病患者中检测到多个系。基于SNP的品系预测对28个样本是可能的，其中2个被确定为属于品系1，3个属于品系2，10个属于品系4.3，13个除了不属于H37Rv外不能进一步分类。

在队列二中，13个参与者中有两个被发现有混合感染（一个通过爆炸，一个通过系别SNP分析），通过爆炸检测的少数人群占总数的6%。总的来说，对13个样本进行基于SNP的品系预测是可能的，其中一个被确定为属于品系1，四个属于品系2，一个属于品系3，一个带有品系1、7（M. tuberculosis）、5、6（M. africanum）、动物品系或M. canettii的标记，六个除了属于H37Rv以外无法进一步分类。

讨论

尽管该研究中提出的数据代表了结核病诊断和药敏试验的一个重要的新研究领域，但也有局限性。由于这项嵌套研究利用了现有的生物库，分析的样本可能存在选择偏差。样本量不大，而且仅限于两个不同的临床人群。此外，无法确定mDST和pDST结果之间的不一致是否由于痰液和粪便中的菌株差异或分子与表型方法的固有差异而存在；关于分子或表型敏感性结果是否应被视为某些结核病药物（如利福平或贝达喹啉）的参考标准的争论仍在进行。由于结核杆菌培养在粪便上的表现很差，因此没有对粪便上的mDST和pDST结果进行比较。最后，虽然这些发现强调了粪便样本上的tNGS作为一种额外的诊断程序的潜在影响，但还需要对粪便和痰液的tNGS进行直接比较的额外研究，以更准确地确定目标人群，也许是高危人群，如PLHIV和儿童，最有可能从粪便检测中临床受益。

结语

该研究首次证明通过将特定的DNA提取方法与靶向基因组测序相结合，可以从粪便样本中获得全面的mDST。文章中描述的方法有可能增加无法提供痰液样本或通过粪便PCR检测到的结核分枝杆菌复合物浓度高于痰标本的患者获得全面mDST的机会。鉴于对耐多药结核病患者新治疗方案的迅速推出，在高负担环境中扩大靶向测序技术的可及性必须成为终止结核病斗争的优先事项。

END 

参考文献：

[1]  Sibandze, Doctor B et al. “Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing.” Genome medicine vol. 14,1 52. 19 May.

撰写丨安娜

编辑、排版丨SX

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