项目文章丨广西大学: 生活在矿区的银耳相思鸟的本地种群与移民种群之间的肠道微生物群比较(国人佳作)

编译：周天龙，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

复杂的肠道细菌群落对机体健康有重大影响。然而，关于栖息地变化对野生鸟类肠道微生物群的影响的了解有限。本研究使用16S rRNA基因高通量测序表征了银耳相思鸟(Leiothrix argentauris)的两个不同亚种，本地物种(L. a. rubrogularis)和移民物种(L. a. vernayi)的肠道微生物群。这两个亚种共同生活在一个重金属污染区，其中L. a. vernayi是被贩运过来。它们是研究野生动物在移动到新栖息地时肠道微生物组如何变化的绝佳系统。我们假设移民种群会发展出与本地种群相同的适应性，以响应栖息地的变化。结果表明，在相似影响因素的共同作用下，本地种群和移民种群肠道菌群的组成、多样性或功能代谢均无显著差异(所有方差分析的p值>0.05)。此外，两个亚种肠道菌群的组成和功能代谢表现出对微量金属损伤的适应性。LEfSe分析表明，移民种群肠道菌群中的Massilia显著高于本地种群，表明移民种群遭受了栖息地改变。最后，我们发现生活在矿区的这两个亚种在其肠道微生物群中具有极高的致病菌比例(约90%)，远高于生活在野生环境中的其他物种(约50%)。本研究揭示了银耳相思鸟的移民种群肠道菌群在重金属胁迫下的适应性，可为矿区生物多样性保护和污染治理提供指导。

论文ID

原名：Comparison of Gut Microbiota between Immigrant and Native Populations of the Silver-eared Mesia (Leiothrix argentauris) living in Mining Area

译名：生活在矿区的银耳相思鸟(Leiothrix argentauris)的本地种群与移民种群之间的肠道微生物群比较

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：6.064

发表时间：2023.1.24

第一作者：周天龙

通讯作者：蒋爱伍

通讯作者单位：广西大学林学院

DOI号：10.3389/fmicb.2023.1076523  

实验设计

结果

1 测序质量和ASV分布

经过严格的质量过滤，共获得482,768个16S rRNA基因reads，平均每个样本25409±3882个序列(中位数：25785)，其中501个ASV来自19个银耳相思鸟(L. a. rubrogularis = 462，L. a. vernayi = 501)的肠道微生物群。秩丰度和稀疏曲线支持测序深度的充分性，表明几乎所有细菌种类都在肠道样品中发现(图1A，B，C，D)。两组共有92.22%的ASV，独特的ASV完全存在于L. a. vernayi(7.78%)。所有ASV都可以在L. a. vernayi中检测到(补充图1)。

图1. L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道微生物群的测序深度分析和ASV分布。

基于Illumina MiSeq测序的所有样本的肠道微生物群的稀疏曲线。横轴：有效测序数据量；纵轴：(A)可操作分类单元的观测数目(丰富度指数)；(B)香农指数；(C)和PD_whole_tree。(D)银耳相思鸟肠道微生物群的秩丰度曲线。横轴：ASV的数量根据丰度，从高到低。纵轴：ASV的丰度。横轴上的跨度曲线越大，物种丰富度越高。纵轴上的曲线越平滑，物种分布越均匀。

2 L. a. rubrogularis和L. a. vernayi的肠道微生物多样性特征

为了评估亚种之间群落丰富度和多样性的差异，对有效序列进行对齐以计算Good’s coverage、丰富度、Shannon和PD_whole_tree指数。每个样本的覆盖率估计范围为99.82%至99.97%，表明覆盖率极佳(图2A)。肠道群落α多样性的测量在L. a. rubrogularis和L. a. vernayi之间没有显著差异(基于单因素方差分析，丰富度指数，p值= 0.4350；香农指数，p值=0.876; PD_whole_tree，p值=0.329)。因此，L. a. rubrogularis和L. a. vernayi之间肠道微生物群的多样性相似(图2B，C，D)。

加权和未加权Unifrac距离用于生成反映个体之间肠道微生物β多样性的PCoA图。无论考虑加权Unifrac距离还是未加权Unifrac距离，L. a. rubrogularis和L. a. vernayi之间均未检测到显著差异(图3A，B，Anosim检验：p值=0.251和0.217，R=0.0945和0.1084)。

图2. L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道微生物群的α多样性。

(A) Good’s coverage；(B)丰富度指数；(C)香农指数；(D) PD_whole_tree。“NS.”两组间差异无统计学意义(P >0.05)。

图3. L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道微生物群的β多样性。

基于加权UniFrac距离(A)和未加权UniFrac距离(B)的主坐标分析(PCoA)。左上角显示了第一个轴上两个亚种的Wilcoxon秩和检验；右下角显示了第二个轴上两个亚种的Wilcoxon秩和检验；右上角显示了基于两个亚种之间Bray-Curits距离的Anosim检验结果。

3 L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道菌群组成特征

几乎所有的reads都可分类到13门、17纲、54目、97科、162属。在门水平上，变形菌门是L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道群落中最丰富的细菌门(88.94，93.46%)，其次是厚壁菌门(6.05，3.12%)、拟杆菌门(2.51，1.24%)和放线菌门(1.65，1.61%)(图4A)。其余其他门的相对丰度较低。图4B显示了L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道微生物群的所有门。每个门在样品中的相对丰度波动很小。

在科水平上，假单胞菌科在L. a. rubrogularis和L. a. vernayi中占主导地位(66.04，63.87%)，其次是肠杆菌科(8.80，9.72%)、弧菌科(6.71，7.48%)、丛毛单胞菌科(1.96，1.80%)、毛螺菌科(1.27，1.38%)、Sphingomonadaceae(1.22，1.25%)、红环菌科(0.87，0.84%)、盐单胞菌科(0.85，0.94%)、气单胞菌科(0.73，0.63%)和Burkholderaceae(0.66，0.66%)(图4C)。图中4D显示了L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道微生物群的前10个科。我们观察到，2个L. a. vernayi样品中肠杆菌科的丰度高于其他样品，甚至超过了假单胞菌科。

在属水平上，假单胞菌属在L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道群落中占主导地位(66.04，63.87%)，其次是志贺氏菌属(7.18，7.90%)、弧菌属(6.56，7.31%)、盐单胞菌属(0.85，0.94)、Novosphingobium(0.84，0.86)、Methyloversatilis(0.81，0.78%)、气单胞菌属(0.71，0.61%)、Hydrogenophaga (0.65，0.63%)、链球菌属(0.64，0.70%)和hgcl_clade(0.63，0.65%)(图4E)。图中4F显示了L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道微生物群的前10个属。两个L. a. vernayi样品中志贺氏菌属的丰度高于其他样品。

图4. L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道微生物群中优势类群的相对丰度。

(A)门；(C)科；(E)属。优势类群在所有样本中的相对贡献。(B)门；(D)科；(F)属。

4 L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道菌群的差异分析

为了进一步研究L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道微生物群落组成是否存在差异，以平均丰度排名前40的属构建了属级聚类热图。虽然聚类划分为两类，但L. a. rubrogularis和L. a. vernayi并未分别归入两类，两组分布非常分散(图5A)。采用LEfSe分析确定两组之间在门、纲、目、科和属水平上丰度存在显著差异的微生物分类群。有趣的是，我们只确定了一个属分类单元Massilia，它在L. a. vernayi中的丰度明显高于L. a. rubrogularis(LDA > 2，p值<0.05)(图5B)。LEfSe分析支持了属级聚类的结果，表明L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道菌群组成基本一致。

图5. 

(A)L. a. rubrogularis和L. a. vernayi微生物群落属级层次聚类热图。(B)通过分支图可视化差异微生物系统发育分布。分类分支图显示了样本群落中主要分类群从门到属(从内环到外环)的分类层次结构。

5 肠道微生物代谢通路的预测与比较

根据预测，KEGG通路数据库将代谢途径分为六类，包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和生物系统。每个代谢通路进一步分为几个级别。第2级包括31个代谢途径亚功能，预测第三级功能途径共159个。图6A显示了所有银耳相思鸟个体肠道微生物群映射到KEGG数据库的二级功能通路的平均相对丰度。KEGG通路表明，“代谢”是肠道微生物群最重要的途径。

Wilcoxon秩和检验显示，L. a. rubrogularis和L. a. vernayi之间的二级代谢途径没有显著差异(图6B) (排除所有样品中相对丰度小于1%的二级代谢途径，并通过Bonferroni校正p值)。前40个三级功能通路丰度的聚类热图显示样品间功能丰度存在差异，但L. a. rubrogularis和L. a. vernayi的个体没有分别聚类为两类(图6C)。结果表明，L. a. rubrogularis和L. a. vernayi的肠道微生物群代谢功能无显著差异。LEfSe分析应用于所有水平的KEGG代谢途径，也没有检测到L. a. rubrogularis和L. a. vernayi之间的任何变化(补充图2)。

图6. L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道微生物组功能代谢的预测(n=19)。

(A) L. a. rubrogularis和L. a. vernayi之间代谢途径相对丰度的KEGG分析。横坐标表示功能通路的相对丰度，纵坐标代表KEGG第二分类级别的功能通路，最右边的方框代表二级通路所属的第一级功能。(B)扩展误差条图，以确定L. a. rubrogularis和L. a. vernayi之间预测基因功能代谢的显著差异。中间值表示组之间的平均差(上柱线值-下柱线值)，误差线表示95%置信区间。零点的右侧表示对L. a. rubrogularis基因功能的影响较大，零点的左侧表示对L. a. vernayi基因功能的影响较大。侧面的P值表示上柱线和下柱线之间的显著性水平。(C) L. a. rubrogularis和L. a. vernayi第三级功能通路的属级分层聚类热图。

讨论

这是第一项显示银耳相思鸟肠道微生物群的研究，其栖息地已被贸易改变。以前的研究集中在比较原生栖息地与圈养。然而，在圈养条件下，宿主的生活环境和饮食是人为控制的，因此很难反映真实野外环境对移民物种肠道微生物群的影响。此外，在自然条件下，宿主的栖息地环境和食物来源是可变的，例如物种内个体之间饮食成分的显著差异，这对于跨物种和跨区域比较难以克服。在这项研究中，本地(L. a. rubrogularis)和移民(L. a. vernayi)种群生活在同一个群体中，因此它们的饮食，环境和其他外部因素相同，并且只有轻微的系统发育差异，这可以提供一个独特的机会来比较移民和本地物种的肠道微生物群。野生动物贸易是引入入侵物种的常见途径。被交易的迁徙物种可能会对本地生态系统、经济活动和人类福祉产生不利影响。我们的研究结果可以帮助评估这种非本地物种入侵的风险，以便更好地理解和管理。

1 移民亚种的肠道微生物群与本地亚种的肠道微生物群趋同

总体而言，我们的研究结果表明，本地亚种和移民亚种在肠道菌群的组成、多样性和功能代谢方面没有显著差异，这可能与相似的饮食、环境和其他外部因素有关。在类似的饮食和环境因素的驱动下，肠道菌群的趋同进化也在其他脊椎动物中被发现。例如，以竹子为食的大熊猫和小熊猫在肠道菌群结构和功能上比它们的肉食性亲戚有更多的相似之处。同样，在对不同种族移民的研究中也观察到了这种现象。随着时间的推移，美国移民的肠道菌群会变得越来越类似于当地人。综上所述，移民群体的肠道菌群发展了与本地群体相同的适应特征，这些适应特征的产生可能有助于移民群体快速适应栖息地变化。

2 矿区银耳相思鸟的肠道菌群特征

土壤中的微量金属可以富集到植物中，昆虫以植物为食，并将微量元素带入体内。因此，银耳相思鸟的广泛食性会使大量的微量元素富集到体内，使其肠道菌群处于微量元素应激环境中。因此，我们还研究了其肠道菌群在微量元素胁迫下的特征。从本地种群和移民种群的肠道微生物群落组成中发现，在门水平上，两个亚种的肠道菌群以变形菌门为主(约90%)，其次是厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。之前的研究发现厚壁菌门是哺乳动物、鸡和野生鸟类肠道中的主要微生物组。厚壁菌门成员在蛋白质等物质营养物质的代谢、消化和吸收中发挥着重要作用，并参与消化酶的合成以协助宿主消化和吸收营养物质。然而，变形菌主要是致病菌，通常与肠道生态失衡、代谢和免疫紊乱有关。对其他野生鸟类的一些研究发现，厚壁菌门是肠道微生物群中的优势物种。然而，在其他几项关于野生鸟类的研究中，变形菌门的丰度高于厚壁菌门。即便如此，与我们的研究中变形菌门几乎占肠道菌群的90%相比，他们的研究中变形菌门仅略高于厚壁菌门。鉴于这些研究中的样本来自圈养或正常的野生环境，这可能表明肠道菌群对微量元素应激的适应可能导致变形菌菌群优势。这与其他物种在微量元素胁迫下的肠道菌群特征一致。

3 肠道菌群在降低重金属毒性中的作用

先前的研究表明，肠道微生物组在保护宿主免受重金属暴露的毒性影响方面发挥着重要作用。在我们的研究中，我们还发现肠道微生物群中的优势分类群对重金属毒性表现出很强的抵抗力。例如，假单胞菌在几乎所有样本中都占主导地位。假单胞菌可以降解纤维素，并产生大量抗生素化合物，可以有效地遏制致病菌和真菌引起的疾病。特别重要的是，假单胞菌对Cd、Pb和As等重金属表现出极高的抵抗力。此外，志贺氏菌、弧菌和盐单胞菌等几个丰度较高的属也具有很高的微量元素抗性。这些细菌可能在抵抗微量元素胁迫、维持银耳相思鸟正常生长发育和生命活动方面发挥重要作用。

本研究还预测了银耳相思鸟肠道微生物群的代谢功能。PICRUSt2预测的代谢途径与其他野生物种预测的代谢途径一致(图6A)。微生物代谢途径(如异种生物降解代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢)占31个预测最丰富的途径的60%以上。这表明银耳相思鸟的肠道微生物组可能参与了高水平的代谢活动，这可能有助于抵抗微量元素造成的损伤。

4 关于L. a. vernayi何时移民的猜测

我们无法评估移民种L. a. vernayi的具体移民时间。根据我们近年来的实地调查结果和一些数据，我们可以推断其最早的迁移时间在2019年左右，因为在2019年之前的实地调查中没有发现它。有趣的是，对所有肠道样本种分类群的LEfSe分析可能支持这一推论。在L. a. rubrogularis和L. a. vernayi肠道菌群的所有分类群中，LEfSe分析检测到一个属，Massilia，其在L. a. vernayi肠道中的相对丰度明显高于在L. a. rubrogularis中的丰度。Massilia是微量元素胁迫环境中重要的抗性微生物，已在矿山土壤、农田土壤、海滩和被微量元素污染的污泥中发现。Massilia可以分泌大量的环糊精，其特殊的物理结构可以结合微量元素离子，从而降低肠道环境中微量元素的含量，降低其对银耳相思鸟的毒性。另一项对蚯蚓的研究也发现，镉污染后土壤中Massilia丰度较高，镉污染中期Massilia丰度下降，后期Massilia丰度上升至稳定水平。这一发现表明，L. a. vernayi的迁移时间并不长。我们推测，在未来，L. a. vernayi肠道中Massilia的丰度将波动，直至与L. a. rubrogularis相似。

结论

综上所述，移民亚种(L. a. vernayi)肠道微生物群的组成、多样性和功能与本地亚种(L. a. rubrogularis)基本相同。生活在矿区的银耳相思鸟的肠道微生物群发展出对微量元素胁迫的适应性特征。本研究的意义在于：(1)研究结果揭示了迁徙物种肠道菌群适应“迁徙”后生境变化的能力。为肠道菌群响应野生动物环境变化的适应机制提供了新的思路，为野生动物保护和生物多样性保护提供了重要启示。(2)结果还显示了微量元素环境胁迫下鸟类肠道菌群的适应机制(如何改变微生物群的组成和功能以抵抗微量元素的毒性作用)。有助于了解微量元素对鸟类的毒性以及鸟类适应微量元素污染的策略，对矿区污染控制和生物多样性保护具有指导作用。

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