VWF清除和与FVIII结合改变儿童血友病A患者的FVIII药代动力学的遗传决定因素

FVIII药代动力学特性在血友病A患者中显示出高度的患者间的变异性。而在之前的研究已经证明了这一点，年龄、体重指数、血管性血友病因子（VWF）抗原水平和ABO血型状态可影响FVIII的药代动力学，但它们不能解释所有观察到的变异性。在本研究中，我们旨在描述43例儿童血友病A患者群体中改变FVIII药代动力学特征的遗传决定因素。我们观察到VWF:Ag和VWFpp/VWFP:Ag，而不是VWFpp，与FVIII半衰期相关。在非O型血型患者中，VWFpp/VWF:Ag与FVIII半衰期呈负相关，但在O型患者中未观察到相关性，这表明经ABO血型修饰的VWF半衰期是FVIII药代动力学的强调节因子。VWF的FVIII结合活性与FVIII半衰期呈正相关，在VWF：FVIIIB降低而VWF：Ag未降低的患者中，发现了罕见或低频率的、非同义的VWF变异p.(Arg826Lys)和p.(Arg852Glu)。既往已明确与血浆VWF和FVIII水平有关的VWF、CLEC4M和STAB2位点的常见变异均与FVIII的药代动力学特征有关。总之，这些研究描述了在儿科人群中VWF清除和ABO糖基化改变FVIII药代动力学的机制基础。此外，本研究首次确定了非VWF和ABO变异体，它们改变了儿童血友病A患者的FVIII药代动力学。

介绍

历史上，血友病A患者治疗的因子VIII（FVIII）浓缩物预防性给药方案是基于体重和IVR。然而，FVIII的药代动力学（PK）曲线在血友病A人群中变化很大，在成人人群中FVIII的半衰期变化超过4倍（6-25小时）。个体间的变异性大于个体内的变异性，尽管存在年龄相关的变化，但终末期半衰期和体重调整后的清除率在患者的一生中高度重复，这表明这一观察的遗传基础。近年来，越来越多的人强调个性化的预防性FVIII给药，以将减少患者的时间在临界谷值以下（0.01–0.03 IU/mL），从而防止自发性关节出血。个体化FVIII给药的剂量和频率可能有很大差异，但影响FVIII PK的因素尚不完全清楚。

影响正常人血浆内源性FVIII:C水平的因素也可能改变血友病A患者的FVIII药代动力学。FVIII与VWF以非共价复合物形式在血浆中循环，VWF作为载体保护FVIII免受活化蛋白C（APC）加速的蛋白水解以及肝脏和脾脏表达的凝血素和清道夫受体的清除。在正常人中，VWF血浆水平升高与FVIII活性增加相关，而在血友病A患者中，内源性VWF:Ag水平先前已被证明与FVIII PK参数相关。在正常个体中，VWF基因内的常见和罕见变体都可以通过生物合成或清除相关机制改变血浆VWF:Ag水平，从而改变FVIII活性。此外，VWF的D'D3 FVIII结合区内的变体可以改变正常个体（杂合遗传）和2N型血管性血友病（VWD）（纯合或复合杂合遗传）中的VWF:Ag和FVIII活性水平。然而，到目前为止，VWF基因变异对FVIII PK的影响尚未得到研究证实。

除了VWF基因的变异外，ABO血型基因位点的变异约占遗传可能性的50%，或对正常人血浆FVIII水平的遗传影响。ABO血型状态通过加速清除O型VWF和可能清除O型VWF结合FVIII的机制改变内源性VWF和FVIII水平。ABO血型先前已被证明与FVIII PK相关，但VWF和ABO血型因子改变FVIII PK的详细机制尚未得到证实。此外，这些因素不能完全解释FVIII药代动力学的高度个体间变异性。通过全基因组连锁分析和全基因组关联研究（GWAS），已经确定了与血浆VWF或FVIII水平相关的VWF和ABO血型位点之外的遗传变异性。CHARGE GWAS荟萃分析确定了400个单核苷酸变异（SNV），这些变异与欧洲血统的正常受试者在8个位点的血浆VWF和/或FVIII水平相关：VWF、ABO、STAB2、SCARA5、TC2N、STXBP5、STX2和CLEC4M。这些关联最近在46000多名正常人的多民族人群中得到证实。STXBP5和STX2编码参与内皮细胞生物合成途径的蛋白质，虽然TC2N的功能未知，但SCARA5、STAB2（stabilin-2）和CLEC4M编码肝和脾中表达的内吞受体，这些受体已被证明能结合、内化和/或调节VWF-FVIII的清除，因此可能影响FVIII PK。

在这项研究中，我们对43例患有严重血友病A的儿童患者进行了FVIII PK分析。我们评估了FVIII PK测量值与血浆VWF特性之间的关联，包括VWF:Ag水平、FVIII结合活性、VWF合成/分泌（VWFpp）和清除（VWFpp/VWF:Ag）的替代标记物。我们对VWF基因的FVIII结合区进行测序，以确定错义变异体，并表征已确定的罕见和低频变异体对这些患者VWF抗原和FVIII结合活性的影响。最后，对研究对象进行CHARGE研究中确定的VWF或FVIII修饰SNV的基因分型，以及CLEC4M VNTR多态性，并评估其与FVIII PK测量的相关性。这项研究是迄今为止对儿童群体中FVIII PK基因调控最全面的分析。

患者、材料和方法：

研究患者：43名患有严重A型血友病的儿童和青少年研究对象（年龄6-17.7岁），是从三个大型学术性儿童血友病中心招募（2012年10月在多伦多，加拿大的儿童医院，在维也纳大学医学院的儿童医院，以及在比利时鲁汶大学的儿科血液学/肿瘤学分部）在2012年10月和2015年8月之间招募的。在获得机构伦理审查委员会批准后，患者参与获得知情同意。受试者的基线血浆FVIII:C<1%，并且没有证据表明存在当前的抗FVIII抑制物或非中和性抗FVIII IgG。受试者人口统计数据见表1和补充表1。

PK研究：参与者服用重组（r）标准半衰期FVIII浓缩物，剂量为50 IU/kg，四舍五入，适合小瓶大小。使用的rFVIII产品见补充表1。按照之前ISTH推荐的采样计划，在静息状态下按以下间隔采集血液：输注前（输注前30分钟内）、输注后1小时（+/-5分钟）、9小时（+/-1小时）、24小时（+/-2小时）和40-48小时。在PK研究前72小时内收集每个受试者的给药史，因此不需要清洗期。

PK分析：FVIII活性通过使用BCS XP止血系统（Siemens,Munich,Germany）或STA compact止血系统（Diagonostica Stago,Parsippany,USA）在皇后大学（加拿大金斯敦）的单个地点进行一步法凝血试验进行测量。如前所述，使用TCIWorks 10.0-RC1程序评估FVIII药代动力学参数。TCIWorks是一种一室模型，先前已被验证用于评估血浆产品和重组产品的FVIII PK参数。FVIII PK特性包括清除率（Cl，mL/h）、消除速率常数（k，h-1）、末端半衰期（t1/2，h）和曲线下面积（AUC，h⋅ mIU/dL）会出报告。

血浆分析：血浆VWF前肽（VWFpp）和VWF:Ag水平通过ELISA（Immucor GTI Diagnostics，Waukesha，WI，USA）测量。VWF:FVIIIB通过固相结合试验进行测量，如所述，使用1.25 U/mL重组FVIII（Advate,Baxter,Deerfield,USA）和HRP结合多克隆羊抗人FVIII抗体（Affinity Biologicals,Ancaster,Canada）进行检测。

基因分型：根据制造商的协议（ThermofisherScientific），通过Taqman实时PCR分析对单核苷酸变体（SNV）rs868875、rs2726953、rs9644133、rs4981022、rs12229292、rs10133762进行基因分型。如前所述，对VWF变异体（rs1063856，rs1063857）进行基因分型，并分析VWF的D'D3和含N-连接聚糖的外显子序列。如前所述，对CLEC4M VNTR基因型进行分析。

统计分析：连续变量和FVIII PK参数之间的相关性由GraphPad Prism 7.03中的双侧Pearson相关系数确定。使用适用于Windows 2018（Armonk,NK,USA）的IBM-SPSS 25.0版对每种SNV的影响进行线性回归分析，并根据年龄和ABO血型状态进行调整。基因型之间的差异通过Mann-Whitney U检验或在GraphPad Prism 7.03（San Diego,CA,USA）中进行的Fisher检验进行评估。p值为≤0.05被认为具有统计学显著性，由于这是一项探索性研究，没有对多重比较进行调整。

结果：患者特征、VWF:Ag、VWFpp和VWF:FVIIB测量值：

患者身体特征和FVIII PK谱见表1和补充表1。我们首先确认了患者年龄与BMI之间的相关性，之前通过Pearson相关系数（表2）将其与FVIII PK相关联。这两个参数与FVIII PK显著相关。接下来，我们评估了基线血浆VWF特性对FVIII PK的影响。我们证实，在我们的儿科人群中，血浆VWF:Ag水平与FVIII PK参数密切相关，包括FVIII半衰期（p<0.0001）和清除率（p<0.0001）（图1A和表2），这与之前的观察结果一致。血浆VWF:Ag水平受修饰其合成和分泌的途径以及调节其从血浆中清除的机制的影响。我们测量VWFpp作为内皮细胞或血小板VWF分泌的替代标志物，以及VWFpp/VWF:Ag比率，作为VWF清除率的间接测量。有趣的是，我们观察到血浆VWFpp水平与FVIII PK（半衰期：p=0.202）（图1B和表2）之间没有显著关联，尽管PK与VWFpp/VWF:Ag（半衰期：p<0.0001）（图1C和表2）之间存在强烈关联，表明VWF从血浆中清除的速率，但不是VWF分泌的速率，强烈地影响了该队列患者的FVIII PK。我们还观察到VWF的FVIII结合能力（VWF:FVIIIB）与FVIII PK（半衰期：p=0.0012）之间存在显著相关性（图1D和表2）。

VWF基因变异：VWF基因中常见和罕见的变异可以改变VWF血浆水平、VWF清除率和VWF的FVIII结合能力。我们对VWF基因中的FVIII结合位点和N-连接聚糖位点进行了测序。在Asn–X–Ser/Thr一致性N-连接聚糖序列上未观察到先前确认被占据的变异。接下来，我们评估了VWF FVIII结合区（外显子17-21、24-27）内发现的非同义变体的影响。五名患者有两种罕见或低频非同义变异的杂合子：c.2477G>A，p.（Arg826Lys），（n=1）；c.2555G>A，p.（Arg852Glu），（n=4）。值得注意的是，在该队列中，p.（Arg826Lys）变体的杂合子患者FVIII半衰期最短（5.3小时），FVIII清除率最快（400 mL/h）（表3）。计算机致病性评估预测p.（Arg826Lys）替代可能影响VWF功能，而p.（Arg852Glu）变异可能是可耐受的（补充表2）。有趣的是，当我们将具有罕见或低频VWF D'D3变异的患者与其他患者队列进行比较时，我们没有观察到VWF:Ag的显著差异（p=0.159）（图2A），尽管VWF:FVIIB（p=0.05）降低（图2B）。克隆到人VWF cDNA中的p.（Arg826Lys）和p.（Arg852Glu）变体的表达并未改变异源HEK 293T细胞系统中的VWF分泌（补充图1A）。使用重组人VWF进行的VWF:FVIII结合试验表明，与野生型VWF相比，p.（Arg826Lys）和p.（Arg852Glu）的结合活性均降低（补充图1B）。

ABO血型：虽然ABO血型先前已被证明可改变FVIII PK，但尚未证明这种关联的机制基础。与之前的研究一致，我们观察到非O型血型比O型受试者的FVIII半衰期更长（p=0.007）（图3A，表4）。虽然非O型受试者的VWF:Ag略有增加（图3B，表4），但这种影响在统计学上并不显著（p=0.299）。重要的是，非O血型与VWFpp/VWF:Ag显著降低（p=0.016）相关，表明VWF半衰期更长（图3C，表4）。接下来，我们进行关联分析，以评估ABO血型对FVIII半衰期的影响。我们观察到O型患者（p=0.011）和非O型患者（p<0.0001）的VWF:Ag和FVIII半衰期之间存在正相关性，尽管非O型患者的相关性更强（图3D）。相比之下，我们观察到非O型个体（p=0.002）的VWFpp/VWF:Ag与O型受试者（p=0.6）的VWFpp/VWF:Ag之间存在显著相关性（图3A），这表明对于非O型受试者，FVIII半衰期的增加与VWF的更长半衰期有关。

CHARGE变异：我们接下来评估了9种SNV对我们儿科人群中FVIII PK参数的影响，这些SNV先前已被证明与正常人血浆VWF或FVIII水平相关。CHARGE SNVs和FVIII PK之间的相关性采用线性回归进行评估，该回归假设附加了遗传模型（表5）。利用Mann-Whitney U来区分参考等位基因纯合子个体（白色条）和杂合子个体（灰色条）之间的影响，以研究非附加效应（图4），对于大多数变体，非参考等位基因纯合子个体的样本量对于该分析来说太小。通过线性回归（表5）和/或Mann-Whitney U（图4A），与FVIII清除率相关的VWF（p=0.05）、CLEC4M（p=0.039）和TC2N（p=0.045）基因变异。通过回归分析，STAB2变体rs4981022与FVIII消除速率常数（k）（p=0.005）、FVIII半衰期（p=0.007）和血浆VWF:Ag（p=0.015）相关，而与Mann-Witney U的参考等位基因纯合患者相比，STAB2 rs12229292变体杂合患者的清除率增加（p=0.016）（图4A）。通过回归分析（表5）或Mann-Whitney U（数据未显示），与FVIII PK或血浆VWF测量相关的SCARA5基因变异均不存在相关性。CLEC4M SNV rs868875与VNTR多态性处于连锁不平衡状态，VNTR多态性已被证明可调节CLEC4M的配体结合亲和力。我们对研究对象的CLEC4M VNTR进行了基因分型，并通过单因素方差分析观察到，VNTR基因型与FVIII清除率（p=0.003）（图5A）、消除常数（k）（p=0.0004）（图5B）和半衰期（p=0.019）（图5C）之间存在显著相关性。CLEC4M VNTR基因型与AUC（p=0.081）、VWF:Ag（p=0.23）和VWFpp/VWF:Ag（p=0.21）之间的相关性无统计学意义（图5D-F）。Tukey关于VNTR基因型差异的事后分析多重比较试验在统计学上不显著，可能是因为研究对象数量较少。最后，我们评估了FVIII清除最快的患者（n=11）的四分位（Q1）、FVIII清除最慢的患者（n=11）的四分位（Q4）以及FVIII半衰期最短的患者（n=11）的四分位（Q1）与FVIII半衰期最长的患者（n=11）的四分位（Q4）的遗传特征。我们观察到CLEC4M rs868875变异与快速FVIII清除率显著相关（p=0.034），而通过Fisher精确检验，CLEC4M VNTR 5等位基因趋向显著性（p=0.069）（图6A）。通过Fisher精确检验，我们还观察到非O血型（p=0.024）、STAB2 RS1222929（p=0.045）和CLEC4M VNTR 9等位基因（p=0.049）与更长的FVIII半衰期显著相关。

讨论：

FVIII药代动力学特性可能受遗传和环境因素的影响；尽管迄今为止尚未确定FVIII PK的遗传力，但它很可能与正常个体的内源性FVIII:C相似，其中遗传贡献估计在57-82%之间。关于FVIII PK的药物基因组学调控的信息很少；患者F8突变类型和LRP1基因型尚未显示与这些参数相关，尽管最近的一份报告描述了LDLR中的c.1773C>T，p.（Asn591=）变异与FVIII清除率和分布体积相关。在这项对43名患有严重血友病A的男孩的FVIII PK决定因素的研究中，我们观察到内源性VWF从血浆中清除的速率以及VWF的相对FVIII结合活性是FVIII PK的重要决定因素。在VWF基因的FVIII结合D'D3区域内，我们在我们的患者群体中鉴定出一种罕见（p.（Arg826Lys））、一种低频（p.（Arg852Glu））、和两种常见变体（p.（Thr789Ala）和p.（Tyr795=）。从1000基因组数据库生成的一项分析先前观察到每个个体有2.5个VWF基因SNV，在>6%的正常个体中发现了罕见或新的非同义编码区变异。当合并具有罕见和低频变异p.（Arg826Lys）和p.（Arg852Glu）的患者时，我们观察到这些患者的VWF:FVIIIB水平显著下降，但VWF:Ag水平没有下降（图2），这与涉及重组VWF变异的研究一致（补充图1）。通过2/3的计算机软件分析，预测p.（Arg826Lys）变体具有致病功能（补充表2）。p、（Arg826Lys）当前未列在VWF变体数据库中(http://www.vwf.group.shef.ac.uk/index.html)，尽管一份先前发表的摘要报告了与2N VWD型相关。相反，尽管p.（Arg852Glu）变异体与2N型VWD无关，但已证明它与血友病A患者的VWF:FVIIB活性适度降低有关。总的来说，这些数据表明，修饰VWF-FVIIB的VWF D'D3变体的杂合遗传可能影响FVII PK。

我们还观察到，常见的VWF变异体p.（Thr789Ala）和p.（Tyr795=）（rs1063856和rs1063857）处于强连锁不平衡状态，与FVIII清除率降低相关（图4和表5）。这一观察结果与先前的研究一致，之前的研究已确定这些变异与正常个体中VWF:Ag和FVIII:C的增加有关，因此与VTE的风险增加有关。先前发表的体外和体内研究表明，这些变异可以增加合成/分泌速率，降低清除率，而不会改变FVIII结合活性。因此，这些变异可能通过改变内源性VWF清除率而影响该人群的FVIII清除率。

我们接下来评估了ABO血型对FVIII PK的影响，FVIII PK是影响内源性血浆VWF和FVIII水平遗传变异性的比例最大。重要的是，我们之前已经证明，儿童群体中ABO血型基因位点对VWF生命周期的影响可能与成人显著不同。虽然VWF:Ag和FVIII:C水平在非O型中老年成人中持续升高，但这种影响在儿科队列中并不明显。在这里，我们观察到非O型患者的FVIII半衰期增加，尽管两组之间的VWF:Ag水平没有统计学差异（图3，表4）。这种效应可能与ABO介导的VWF清除率的影响有关，因为非O组的VWFpp/VWF:Ag比率显著降低。有趣的是，非O型组FVIII PK参数的变异性大于O型组，可能是因为该人群中非O型基因型（AA、AB、AO、BB、BO）的多样性。除VWF和ABO外，许多其他遗传变异已被证明与正常成人群体中的VWF和FVIII血浆水平相关。鉴于在我们的儿科人群中观察到FVIII PK参数与VWF清除率之间的关联，我们研究了STAB2、CLEC4M和SCARA5基因中的变异，这些基因编码被认为可以改变VWF-FVIII清除率的细胞表面受体，以及目前功能未知的TC2N。在我们的儿科患者中，STAB2、CLEC4M和TC2N变异表现为，与之前在Charge研究中报告的VWF水平具有相同的方向性和相似的效应大小（补充表6）

STAB2编码stabilin-2，一种H类清道夫受体，表达于肝脏和脾脏的窦状内皮细胞上。Stabilin-2表达细胞可在体外结合并内化VWF，Stabilin-2 KO小鼠显示人VWF和VWF结合FVIII的半衰期增加，但不增加VWF游离FVIII的半衰期。此外，stabilin-2调节小鼠前肽的清除，这表明VWFpp/VWF:Ag比率可能无法捕获所有非VWF基因变体对体内VWF清除率的影响。STAB2基因中罕见的致病性变异先前与正常人群中VWF:Ag水平升高相关，与“低VWF”或1型VWD患者中VTE或VWF:Ag风险增加相关。在此，我们通过回归分析或Mann-Whitney U观察到与FVIII PK参数相关的两种CHARGE STAB2变体（图4，表5）。此外，rs4981022变异与FVIII半衰期、消除速率常数和AUC相关，以及VWF:Ag相对较大~19%的下降。尽管考虑到CHARGE研究中报告的受试者年龄中位数在44.9-72.3岁之间，该效应大小大于预期，但在儿童对比成人人群，VWF清除率可能存在STAB2依赖性差异。

CLEC4M是一种甘露糖特异性凝集素受体，由肝、脾和淋巴管内的内皮细胞表达。CLEC4M的颈部区域由可变数量的串联重复（VNTR）区域（3-9个重复）组成，该区域支持分子的四聚化并调节其配体结合亲和力。我们之前已经证明，表达CLEC4M的细胞能够结合并内化VWF-FVIII复合物和无VWF的FVIII。CLEC4M VNTR变异体与rs868875变异体存在连锁不平衡，这些变异体与“低VWF”或1型VWD患者的VWF抗原或活性水平相关。在本研究中，我们观察到rs868875与FVIII清除率和AUC相关（图4，表5），VNTR变体与FVIII清除率、k、半衰期和AUC相关，但与VWF:Ag或VWFpp/VWF:Ag无关（图5），尽管每个基因型的样本量排除了多重比较试验。CLEC4M变体与VWF:Ag或VWFpp/VWF:Ag之间缺乏相关性可能反映了样本量小，以及CLEC4M可以调节VWF游离FVIII清除率的观察结果。我们还观察到快速FVIII清除的个体中rs868875和VNTR 5的比例增加，FVIII半衰期长的个体中VNTR 9的比例增加（图6）。这一观察结果与我们之前的体外研究一致，在体外试验中，与VNTR 6和7相比，CLEC4M VNTR 9变体与VWF内化受损相关。

VWF:Ag、age和FVIII PK之间的关联以前已经得到了很好的描述，年龄越大，FVIII半衰期越长，VWF:Ag越高。这一观察的基础被认为与年轻队列中较少的病理生物学或环境影响对血浆VWF水平的累积有关。关于VWF遗传力的研究一直对年轻人群中受遗传因素影响的VWF变异比例做出更高的估计。因此，可以得出结论，FVIII PK的遗传率在儿科人群中也可能更高，在成人队列中重复或确认这些观察结果可能是有必要的。

血浆中VWF水平高度可变且连续分布于正常人群中，可被环境因素、VWF基因的变异和外部遗传位点所修饰，使其成为一个难于量化的特点。因此，FVIII的药代动力学曲线也可能受到环境和多基因影响的调节。在本研究中，我们单独评估了每个变异的影响，因为测试的变异数量相对较多，且本研究的样本量较小，排除了多变量分析的可能性。然而，未来对更多受试者群体的研究可能允许对整个模型进行测试，或对模型中单个变量的影响进行验证。

总之，这些研究首次证明FVIII PK主要受血浆中VWF清除的相对速率调节。VWF清除的常见遗传影响因素，包括ABO血型、VWF基因变异以及VWF清除受体CLEC4M和stabilin-2中的变异，也会影响患者FVIII PK谱。FVIII PK决定因素的未来研究可能集中于寻找这些基因中对FVIII PK有更大贡献的罕见功能获得和丧失变异。此外，他们证明VWF-FVIII结合的差异也可以改变FVIII PK，这表明VWF游离FVIII的加速清除可以影响FVIII PK，并且VWF D'D3延长半衰期产品的临床使用可能对这些受试者有益。这项研究已经开始阐明血友病A人群中FVIII PK变异的药物基因组学基础。虽然这些研究并不打算取代个体患者的PK分析，但它们可能会提供改进FVIII替代产品半衰期的新策略的见解。

Blood   .    2019 Sep 12;134(11):880-89