中科院深圳先进院赵国屏/赵位团队开发基于CRISPR-Cas12a的新冠突变提检测技术

2022年1月30日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所 赵国屏 - 赵维 课题组在 Sensors and Actuators B：Chemical 期刊发表题为： RT-RPA-Cas12a-based assay facilitates the discrimination of SARS-CoV-2 variants of concern 的研究论文。

该研究开发了 基于RT-RPA和CRISPR-Cas12a联合技术来检测和区分SARS-CoV-2突变体的检测工具——RRCd 。该研究通过使用优化的RPA引物以及特异的crRNA, 可快速、准确检测单碱基突变、小片段缺失的变异株 （包括N501Y、T478K 以及ΔH69-V70等） ，在Ct<33的临床样品中能达到100%的准确性。

该技术无需依赖其他仪器，可快速、准确地实现即时核酸检测 （POCT） ，可应用于家用新型冠状病毒及其他核酸病毒检测，相对于抗原-抗体检测具有灵敏度高，发现早的优势。

自2020年11月以来，世界卫生组织已发布了5种广泛流行的SARS-CoV-2变异株，即 Alpha、Beta、Gamma、Delta 和 Omicron，并指定为“密切关注的突变体”。逆转录实时定量PCR （RT-qPCR） 作为典型的核酸检测技术，可以灵敏、准确地定量样本中的RNA病毒。

然而，由于RT-qPCR是一种基于扩增子的检测方法，并不适用于对SARS-CoV-2突变体进行基因分型。目前，对SARS-CoV-2突变体的检测方法主要基于全基因组测序。可是，全基因组测序不仅依赖于大量仪器和训练有素的人员，而且耗时长、成本相对高。

事实证明，与传统的PCR或全基因组测序等方法相比，基于CRISPR技术的核酸诊断方法在特异性和可操作性方面具有独特的优势。目前，两种基于CRISPR的SARS-CoV-2诊断方法，即DETECTR和SHERLOCK，已被开发出来并用于SARS-CoV-2检测，具有快速、超灵敏和易于实施的特点。然而，尽管基于CRISPR的核酸检测取得了巨大成功，但目前用于SARS-CoV-2突变体的检测技术仍缺乏。最近，有报告一种名为miSHERLOCK的SARS-CoV-2突变体检测技术，该方法基于CRISPR-Cas13a技术，使用较少的仪器设备就能提供视觉读数，从而部分实现了即时检测。但是，这些方法均未能提供大样本的临床数据进行验证。

为了解决上述问题，该研究开发了一种快速、灵敏、准确的病原突变体核酸检测方法。利用CRISPR-Cas12a技术，通过设计特异的crRNA实现对SARS-CoV-2中点突变的识别。同时，将CRISPR-Cas12a技术与胶体金技术相结合，实现对检测结果的可视化读取。而且，该方法利用特殊的病毒裂解液，实现了对SARS-CoV-2病毒核酸的直接释放并无缝衔接后续的扩增和检测步骤。该研究完全免除了对仪器设备的依赖性，真正实现了即时检测 （图1）

图1. SARS-CoV-2突变体核酸检测技术路线图

为了检测本方法对SARS-CoV-2突变变体的特异性和灵敏度，通过设计crRNA并利用优化后的RT-RPA引物分别对SARS-CoV-2假病毒及其含有SARS-CoV-2中ΔH69-V70，N501Y和T478K等突变假病毒进行测定。结果显示该方法可以很容易地区分了S蛋白中的突变，包括首次报道的Beta谱系的N501Y （图2A） 和最近报道的Delta和Omicron谱系的T478K （图2C） 。此外，它还可以区分S基因上的小缺失，例如来自Alpha和Omicron谱系的ΔH69-V70 （图2E） 。为了确定本方法的灵敏度，分别对用于通用检测的E基因以及S基因的N501、Y501、T478和K478进行检测。结果显示，所有靶标区域 （E基因、N501、Y501、T478和K478） 的检测线约为10个拷贝，相当于RT-qPCR检测Ct值为35。

图2. 检测对SARS-CoV-2突变体的特异性

为了进一步评估该方法在SARS-CoV-2突变体临床样本方面的检测性能，对S基因的501和478位点进行检测。N501Y作为Alpha、Beta、Gamma和Omicron等变异体的常见突变位点。该方法对共采集到的68份临床样本进行了突变体检测。在这68份临床样本中，经过基因组测序鉴定有28份为N501样本和19份为Y501样本。结果显示，在Ct <33样本中能够区分所有突变体 （图3A） 。然而，当检测Ct值超过33的样本时，本方法的辨别能力显著下降，这可能是受限于S基因501位点的灵敏度。S基因478位点可用作识别Delta和Omicron谱系的重要靶标，本次研究中共收集了40个临床阳性样本，经基因组测序鉴定包括7个T478 样本和14个K478样本。结果显示能够区分所有靶向S基因的478位点 （图3B） 。综上所述，这些临床数据表明，本研究能够准确、灵敏地检测和区分SARS-CoV-2突变体。

图3. 对SARS-CoV-2突变体临床样品的特异性检测

中科院深圳先进院合成生物学研究所赵国屏院士、赵维副研究员，上海国际旅行卫生保健中心副主任田桢干为论文共同通讯作者，中科院深圳先进院合成所的研究助理唐桂月、上海国际旅行卫生保健中心张子龙博士及中科院深圳先进院合成所的助理研究员谭为为共同第一作者。该研究得到王金教授、戴珩博士和杨晓楠博士的建议和帮助，得到张先恩教授课题组提供的假病毒支持。该研究得到国家科技部重点研发计划、中科院先导b、国家自然科学基金委、深圳合成生物学创新研究院等多个项目支持。