杨乃彬医生团队解读：抑制mPGES-2通过血红素激活NR1D1改善NASH

为分享肝脏疾病诊疗经验，帮助临床医生了解肝脏疾病领域相关成果和研究思路，提高临床医生的科研意识、科研能力与诊疗水平，肝胆相照平台与宁波市第一医院杨乃彬医生团队联合推出精品栏目--“顶刊之声”。 

“顶刊之声”第六期，杨乃彬医生团队对发表于Hepatology的一篇研究进行解读，以启迪临床。

摘  要

背景：微粒体前列腺素E合成酶-2(mPGES-2)是一种前列腺素E2(PGE2)合成酶，但它在肝脏中不能合成PGE2。本研究的目的是探讨mPGES-2在肝脏脂肪变性和脂肪性肝炎中的作用和机制。

方法：使用mPGES-2全基因敲除小鼠、肝脏特异性mPGES-2基因敲除小鼠进行研究。与对照组相比，mPGES-2基因缺陷小鼠的肝脏脂肪蓄积减少，肝脏损伤、肝脏炎症和肝纤维化均减轻。而且，mPGES-2缺陷减轻NAFLD的作用依赖于CYP4A14水平的降低和ACOT4水平的增加，而CYP4A14和ACOT4受NR1D1调控。NR1D1是血红素(Heme)的受体，Heme增加NR1D1的活性受mPGES-2缺乏的介导。作者还发现mPGES-2的抑制剂SZ0232可用于治疗NAFLD, 从而发挥保护作用。

结论：本研究表明mPGES-2有致病作用，阐明了其介导NAFLD发病的机制，提示抑制mPGES-2可用于治疗肝脏脂肪变性和脂肪性肝炎。

正  文

引 言

开发新的作用靶点和药物，是防治NASH的关键。mPGES-1，mPGES-2和cPGES(胞质前列腺素E2合酶)是目前已知的三种前列腺素E2合酶。mPGES-2是第一个被发现具有双向功能的酶，与GSH、血色素(heme)形成复合物。不论是否结合血红素，mPGES-2都可催化PGH2(前列腺素H2)转化成MDA或PGE2。作者既往研究发现mPGES-2缺陷可经胰岛素信号通路，增加GLUT2(肝脏葡萄糖转运蛋白2)表达, 表明mPGES-2可能参与肝脏糖脂代谢。mPGES-2与GSH、heme(血红素)形成复合物。血红素通过募集NCoR(一种核内基因抑制因子)，增加NR1D1介导的特定靶基因的转录抑制。NR1D1抑制代谢、炎症和心血管相关基因的表达，而mPGES-2与heme的结合可增强NR1D1的抑制作用。

本文中作者研究mPGES-2如何影响NAFLD发展以及NR1D1是否参与其中。作者使用mPGES-2全基因敲除小鼠、肝细胞特异性mPGES-2敲除小鼠给予高脂饮食(HFD)或蛋氨酸胆碱缺乏饮食(MCD)，以及mPGES-2敲除的db/db糖尿病小鼠(db/db，瘦素受体基因缺陷，是经典的糖尿病小鼠模型)，评估mPGES-2对于NAFLD进展的作用。使用mPGES-2抑制剂SZ0232处理小鼠，进一步研究mPGES-2对NAFLD的作用。研究发现：mPGES-2可能是治疗肝脂肪变(NAFL)和NASH的一个靶点。

研究结果

一、mPGES-2缺乏可抑制NAFL

为研究mPGES-2对NAFLD进展的影响，作者繁育WT小鼠、Ptges2-/- KO小鼠。高脂饮食HFD喂养小鼠证实：与野生型(WT)小鼠相比，mPGES-2全基因敲除小鼠经HE染色和油红O染色、检测血清及肝内甘油三酯及总胆固醇水平，发现NAFLD相关的参数(包括脂肪变评分、炎症评分、气球样变评分、NAS评分、油红O阳性区域和肝内脂肪蓄积)均减轻(图1A-C)。而且，与WT小鼠相比，Ptges2-/-小鼠肝脏炎症(经CD86染色评估)和肝脏纤维化(Masson染色、天狼星红染色)也减轻。Ptges2-/-小鼠肝酶ALT和AST较低(图1D)。而且，Ptges2-/-小鼠出现胰岛素耐受增强。以上结果表明：mPGES-2缺乏可以减轻NAFLD相关的指标、改善肝功能。

75%T2DM患者合并NAFLD，因此作者使用db/db糖尿病小鼠(其可以逐渐发展为肥胖、严重T2DM和肥胖相关NAFLD)进行研究。使用Ptges2-/-小鼠与db/m小鼠杂交，产生db/db Ptges2-/-小鼠和db/db Ptges2+/+小鼠。与db/db Ptges2+/+相比, db/db Ptges2-/-小鼠肝脏体积、肝脏指标、NAS评分、脂肪蓄积、血清TG水平和肝脏TG含量均降低(图1E-G)。此外，mPGES-2敲除明显抑制db/db小鼠的肝脏炎症和肝纤维化。与db/db Ptges2+/+相比，db/db Ptges2-/-小鼠的ALT明显下降(图1H)。这些结果表明，mPGES-2缺乏可以在不同的模型中减轻NAFLD进展。

图1

二、敲除mPGES-2可抑制NASH进展

为进一步研究mPGES-2在NASH进展中的作用，作者对Ptges2-/-和Ptges2+/+小鼠进行蛋氨酸胆碱缺乏饮食(MCD)喂养4周。研究发现，在MCD喂养条件下，相比Ptges2+/+小鼠，Ptges2-/-小鼠的肝脏组织中NAS评分、小叶炎症和气球样变的程度明显降低(图2A-B)；Ptges2-/-小鼠脂滴蓄积、肝脏甘油三酯水平、血清ALT和AST水平均下降(图2A-D)；Ptges2-/-小鼠的肝脏炎症减轻(CD68减少)、肝脏纤维化减轻(图2E-F)；作者随后检测肝脏组织中炎症和纤维化相关基因的表达，发现mPGES-2基因缺陷小鼠对于MCD诱导的肝脏炎症和纤维化具有明显的保护作用(图2G-H)；检测肝脏中PEG2发现mPGES-2基因敲除不影响肝内PGE2水平; 总之，mPGES-2缺乏可有效减轻NASH进展。

图2

三、肝细胞特异性mPGES-2敲除可防止NASH相关脂肪变、炎症、纤维化

为确定mPGES-2在肝脏中的具体作用，给Ptges2flox/flox小鼠注射AAV8-TBG启动子-cre-GFP或对照病毒AAV8-TBG-GFP，以获得肝细胞特异性mPGES-2缺陷小鼠(HepKO)或对照小鼠(flox)，并喂MCD饮食4周。与mPGES-2全基因敲除小鼠的反应相似，肝细胞特异性mPGES-2缺失小鼠与对照小鼠相比，脂肪变性较少，肝功能改善(图3A-D)。此外，与对照组相比，肝细胞特异性mPGES-2缺乏对小鼠的炎症和纤维化有很强的保护作用(图3E-H)，表明mPGES-2在NASH发病机制中起着重要作用。

图3

四、mPGES-2缺乏的保护作用依赖ACOT4和CYP4A14信号通路

为了阐明mPGES-2缺乏对NAFLD的保护作用机制，作者对Ptges2+/+和Ptges2-/-小鼠的肝组织进行了蛋白质组学分析，并观察到与NAFLD和脂质代谢相关的途径显著改变(图4A)。此外，当mPGES-2缺失时，酰基辅酶a硫酯酶4(ACOT4)水平显著升高，而细胞色素P450 4A14 (CYP4A14)和CYP4A10水平下降(图4A)。这些结果通过qRT-PCR和对Ptges2+/+和Ptges2-/-小鼠肝组织WB证实(图4B-E)。Ptges2+/+和Ptges2-/-小鼠分别饲喂HFD或MCD饲料或db/db背景。

CYP4A14和CYP4A10是人CYP4A羟化酶的同源物，已知其催化小鼠中链脂肪酸和花生四烯酸的ω-羟化。先前的研究表明，在自发性NAFLD模型和喂食HFD和MCD饮食的诱导性NAFLD小鼠中，肝脏CYP4A14水平显著升高，而CYP4A14缺乏可减弱肝脏脂肪变性和纤维化。在本研究中，作者观察到mPGES-2缺失后CYP4A水平显著下降(图4B-E)。ACOT4是一种过氧酶体琥珀酰辅酶a硫酯酶，负责终止中链二羧酸的β-氧化，同时释放游离酸。

此外，mPGES-2过表达降低了油酸和棕榈酸刺激下HepG2细胞的ACOT4水平(图4F)，与体内实验结果一致(图4C-E)。在过表达mPGES-2的细胞中，通过挽救ACOT4的表达减少了脂质积累(图4G)，这表明mPGES-2抑制对NAFLD的保护作用取决于ACOT4的激活。

为了进一步分析CYP4A14和ACOT4在体内的作用，作者通过尾静脉输注AAV8-tg-CYP4A14-GFP获得的肝细胞特异性CYP4A14过表达小鼠构建到mPGES-2 KO HFD小鼠中，并通过GalNac ACOT4在肝脏中抑制ACOT4。肝脏中CYP4A14的过表达显著加速了饲喂HFD的mPGES-2 KO小鼠的脂质积累和肝功能障碍。结果表明，抑制mPGES-2可能通过抑制CYP4A14和促进ACOT4表达来缓解脂肪变性。

图4

五、mPGES-2竞争性结合血红素与NR1D1，调节E4BP4和CYP4A14的转录

为了进一步探讨NAFLD中mPGES-2缺失后ACOT4上调和CYP4A14下调的机制，作者进行文献检索。基于JASPAR预测，作者观察到E4BP4与ACOT4启动子结合。E4BP4是多种细胞和病毒启动子的转录调节因子，其在肝脏中的过表达会损害与肝脏游离脂肪酸通量增加和脂肪酸利用率降低相关的能量代谢。既往研究表明NR1D1抑制E4BP4和CYP4A14的转录，NR1D1的功能主要依赖于血红素。NR1D1是一种转录抑制因子，以血红素依赖的方式协调昼夜节律和代谢途径。由于血红素浓度调节NR1D1的转录抑制活性，mPGES-2与血红素结合形成复合物，mPGES-2缺失导致更多的血红素释放，从而促进NR1D1下游靶点的转录活性。作者假设mPGES-2竞争性结合血红素与NR1D1抑制E4BP4转录，从而促进ACOT4参与NAFLD。结果表明，mPGES-2可能通过抑制NR1D1的活性影响NAFLD的发展，但不影响PGE2的产生。

此外，在NAFLD条件下，mPGES-2是否通过NR1D1调节CYP4A14和ACOT4的转录仍不清楚。通过荧光素酶报告基因检测，作者发现NR1D1抑制CYP4A14的转录，而mPGES-2过表达抑制NR1D1介导的CYP4A14的转录变化(图5A)。相反，E4BP4过表达抑制ACOT4的转录(图5B)。作者进一步证实NR1D1可抑制E4BP4 mRNA的表达；暴露于血红素类似物hemin后，这种抑制作用得到加强，而NR1D1诱导的E4BP4阻断在过表达mPGES-2的细胞中被取消(图5C)。作者还观察到NR1D1增加了ACOT4 mRNA的表达，这被E4BP4过表达所阻断(图5D)。此外，当细胞暴露于有或没有mPGES-2过表达的hemin中时，NR1D1对ACOT4表达的抑制作用被放大；然而，暴露于NR1D1的拮抗剂SR8278后，这种表型发生逆转(图5E)。结果表明NR1D1可能与mPGES-2竞争血红素结合，负调控E4BP4表达，在NAFLD进展过程中抑制ACOT4转录。此外，油红O染色显示mPGES-2过表达加速了脂质积累，hemin处理可以逆转这一过程(图5F-G)。结果表明，抑制mPGES-2可能释放额外的血红素与NR1D1结合，从而抑制CYP4A14和E4BP4的转录，同时促进ACOT4的转录活性，以防止NAFLD的进展。

图5

六、mPGES-2抑制剂SZ0232可减弱NAFLD的发展

为了进一步评估mPGES-2在NAFLD中的作用，作者使用了mPGES-2抑制剂SZ0232，该抑制剂由作者小组筛选和鉴定。随着SZ0232浓度的增加，吸收光谱中的mPGES-2-血红素峰逐渐降低(图5H)，说明SZ0232可以阻断血红素与mPGES-2的结合。给予生理盐水或SZ0232的小鼠同时喂食HFD 12周。作者进一步对db/db小鼠进行SZ0232处理，发现SZ0232显著降低肝重比、脂质积累、血清和肝脏脂质含量，恢复肝功能(图6A-D)。为了进一步评估SZ0232对脂肪性肝炎的影响，小鼠被喂食含有盐水或SZ0232的MCD饮食4周。通过评估油红O染色、肝脏TG水平、ALT活性和炎症灶的存在，SZ0232治疗分别显著降低了脂肪酸的积累、肝损伤和肝脏炎症(图6E-H)。肝脏炎症的减少与CD68阳性染色减少和肝脏炎症因子如Ccl2、Il-6、Cxcl2和TNF-α的富集降低有关。此外，通过马松三色染色和天狼星红染色显示，SZ0232治疗后肝纤维化得到缓解，纤维化标志物的表达减少。结果表明mPGES-2可能是一种治疗靶点，SZ0232可能是一种预防NAFL向NASH进展的治疗选择。

图6

参考文献: Inhibition of mPGES-2 ameliorates NASH by activating NR1D1 via heme. Hepatology. doi:10.1002/hep.32671

本文仅供医疗卫生专业人士为了解资讯使用，不代表本平台观点。该等信息不能以任何方式取代专业的医疗指导，也不应被视为诊疗建议。如该等信息被用于了解资讯以外的目的，平台及作者不承担相关责任。

打赏