纳米抗体-HRP夹心ELISA检测牛奶中沙门氏菌及其在鸡体内

引语

在所有食源性病原体中，伤寒沙门氏菌（S.T）和肠道沙门氏菌（S.E）是危害性最大的动物传染病病原体。肠道沙门氏菌每年在美国引发135万感染病例、2.65万住院病例和420个死亡病例。许多国家食品安全法规要求严格监控肠道沙门氏菌，设计灵敏快速的检测技术监测沙门氏菌为降低其流行率提供重要手段。纳米抗体（Nbs）是来自于骆驼或鲨鱼免疫球蛋白重链的单域抗体（sdAbs），分子量约15 kDa，它代表了具有完全抗原结合能力的最小抗体单位。与常规抗体相比，天然纳米抗体具有特殊性能，如高亲和力、热稳定性、易于生产、更高的多样性，且由于互补决定区3（CDR3）较长而提高了其检测隐性表位的能力。纳米抗体融合信号报道蛋白作为检测试剂开发免疫分析方法已有较多报道，纳米抗体-信号报道蛋白融合体表现出很高亲和力，并在不需要二抗的情况下直接用于检测，这种策略有效缩短检测时间并减少检测试剂的使用。本研究筛选了肠道沙门氏菌纳米抗体并融合HRP酶用作捕获试剂，开发了夹心ELISA方法检测牛奶中沙门氏菌，并用于研究沙门氏菌在鸡体内的定植分布。

图文导读

一、构建VHH文库及S.E特异性纳米抗体的筛选和表达

纳米抗体筛选过程示意图见scheme 1。首先将S.E FY-04菌株甲醛灭活，其最终免疫浓度为1×109 CFU/mL。4岁健康骆驼共免疫5次，每2周一次，免疫后采集静脉血通过间接ELISA测定血清效价，由图1a，血清效价达到1:64000，表明免疫组骆驼产生强免疫应答。最后一次免疫后3-4天采集外周血分离淋巴细胞，提取总RNA后反转录获得cDNA。如Scheme 2所示，VHH片段由两步PCR扩增获得，CALL001和CALL002是第一轮扩增引物，VHH-FOR和VHH-REV为第二轮扩增引物，如图1b和1c，第一轮PCR获得大约700 bp和900 bp的cDNA片段，第二轮PCR获得约400 bp的cDNA片段。第二轮扩增引物克隆至pMECS载体中，将获得的重组质粒载体导入大肠杆菌TG1中，并通过平板计数法计算库容，10倍逐级稀释菌液涂布平板，在第7级稀释后平皿上获得23个单菌落，计算后获得库容为2.3×109 PFU/mL。最后VHH文库保存在LB培养基（20%甘油）中，-80°C保存。

Scheme 1: 噬菌体展示技术筛选纳米抗体

Scheme 2: VHH文库构建示意图

图1: VHH文库构建; 1a, 第5次免疫后血清效价; 1b, 第一轮PCR后获得的700 bp片段; 1c 第二轮PCR后获得的400 bp片段; 1d通过10倍逐级稀释, 计算纳米抗体文库库容, 在第7次稀释后，平皿上有23个单菌落，库容为2.3Í109 PFU/mL。

通过4轮淘选获得S.E特异性纳米抗体。首先培养VHH文库并感染M13K07辅助噬菌体以获得救援噬菌体。96孔板中包被灭活S.E菌株，3%脱脂牛奶封闭，然后加入救援噬菌体，37℃孵育1h，PBST洗涤10次，再加入100 μL TEA溶液，室温孵育10 min洗脱特异性救援噬菌体，立即加入Tris-HCl中和。将救援噬菌体导入TG大肠杆菌，评估效价并进行扩增，扩增的救援噬菌体用于下一轮淘选。从第3和第4轮淘选噬菌体中随机选择96个克隆，由图2a，96个克隆均能特异结合S.E。然后通过IPTG诱导表达可溶性纳米抗体（含有HA和His标签），通过间接ELISA检测是否存在S.E特异性纳米抗体，并对阳性克隆进行测序，获得氨基酸序列。最终获得4株S.E特异性纳米抗体，命名为SE-Nb1, SE-Nb9, SE-Nb42, and SE-Nb66，见图2b，其中SE-Nb1序列在96个克隆中重复了44次。所有4株纳米抗体均对S.E具有高亲和力，见图2c。

图2 筛选S.E特异性纳米抗体. 2a, 鉴定挑选的96个克隆周质提取物对S.E特异性结合能力; 2b, 根据CDR区氨基酸序列对筛选的4株纳米抗体进行分类; 2c 鉴定筛选的4株纳米抗体对S.E结合能力.

使用pET-25b+质粒（表达后C端含HSV标签和His标签）在周质中表达S.E特异性纳米抗体。将纳米抗体基因序列扩增，并连接到pET-25b+中构建pET-25b+-VHHs 重组质粒。转入BL21(DE3)大肠杆菌，IPTG诱导表达后通过间接ELISA评估周质提取物结合能力。再使用镍柱纯化纳米抗体，表达及纯化产物通过SDS-PAGE和WB进行验证。纯化的纳米抗体通过间接ELISA鉴定其结合能力、特异性、交叉反应率。通过鉴定表明，筛选的4株纳米抗体可以在pET-25b+中可溶性表达，均具有较高结合能力，与其他3种沙门氏菌和5中非沙门氏菌菌株无交叉反应（见图3）。

图3 表达、纯化、鉴定筛选的4株纳米抗体; 3a, SDS-PAGE图；3b, WB图；3c, 效价测定结果； 3d, 交叉反应率

二、pCMV‐N1‐vHRP载体构建及制备S.E特异性Nb-HRP融合蛋白

设计的pCMV‐N1‐vHRP载体旨在用于纳米抗体融合蛋白表达。生工公司合成了分泌肽信号序列、HA标签序列、多克隆位点、linker、vHRP序列和7ÍHis序列，这些序列使用NheI和XbaI完全消化，然后连接到商业化载体pEGFP-N1中，成功构建pCMV‐N1‐vHRP载体。为了将纳米抗体与HRP融合表达，将筛选的4种VHH基因扩增后连接到pCMV‐N1‐vHRP载体多克隆位点，命名为pCMV-Nbs-vHRP。再将该质粒载体导入HEK293T细胞，培养72h后，离心收集培养物上清，将含有Nbs-HRP融合蛋白的上清加0.02%的NaN3(w/v)，4 ℃保存备用。通过间接荧光免疫分析法和WB分别测定细胞上清中Nbs-HRP的表达（相对于FITC和HRP标记的羊抗鼠二抗，鼠HA单抗不仅作为一抗，在这两个分析中也作为二抗）。并通过直接ELISA评估Nbs-HRP的特异性、效价、交叉反应率（HA单抗做二抗）。WB结果表明，这些Nbs-vHRP分泌到细胞上清中，分别命名为SE-Nb1-vHRP、SE-Nb9-vHRP、SE-Nb42-vHRP、SE-Nb66-vHRP（图4b）。筛选的4种纳米抗体通过直接ELISA表明，均与S.E特异性结合，具有较高结合能力，与其他菌株无交叉反应（图4c, 4d, 4e）。

图4 4种SE-Nbs-vHRP的制备与表征; 4b 通过抗His单抗的WB结果; 4c 直接ELISA验证4种SE-Nbs-vHRP与S.E特异性结合; 4d 测定4种SE-Nbs-vHRP效价;  4e 评估4种SE-Nbs-vHRP对其他菌株交叉反应性.

三、建立双纳米抗体夹心ELISA检测S.E

拟通过SE-Nbs作为捕获抗体，SE-Nbs-vHRP作为检测抗体建立双纳米抗体夹心ELISA检测S.E。通过棋盘法筛选最佳抗体配对，首先将100 μL 4种不同SE-Nbs按800 ng/孔4 ℃过夜包被，脱脂奶封闭，加入抗原S.E（1×108 CFU/孔）37 ℃孵育1 h，设置阴性对照组加入等量的NaHCO3缓冲液。再分别加入100 μL 4种不同SE-Nbs-vHR（稀释10倍），37 ℃孵育1 h。之后加入显色液并终止，测定OD值。选择P/N值最大的抗体对为最佳配对，由图5a，最佳抗体配对为，SE-Nb做捕获抗体，SE-Nb1-vHRP做检测抗体，此时P/N值最大为12.06。再通过棋盘法确定捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度，使用最佳抗体配对建立标准曲线，并测定交叉反应率（图5b, 5c,5d）。通过4参数方程拟合获得标准曲线，LOD值为5×104 CFU/mL。交叉反应率实验表明，建立的方法对S.E FY04和S.E13076菌株具有较好反应性，与其他菌株无交叉反应。

图5 建立双纳米抗体夹心ELISA检测S.E；5a 棋盘法确定最佳抗体配对；5b 棋盘法确定捕获抗体和检测抗体最佳浓度；5c 交叉反应实验；5d 标准曲线

四、基于双纳米抗体夹心ELISA检测牛奶中S.E，及分析S.E在鸡体内定植情况

牛奶样品为附近超市购买，制备S.E浓度为1×106, 1×107 and 1×108 CFU/mL的加标样品，5000 rpm离心10 min，使用建立的夹心分析方法测定沉淀中S.E含量分析回收率。回收率在97.02%-108.59%之间。表1 所建立方法检测牛奶中S.E的回收率将雏鸡分为2组，实验组给予口服1×108 CFU S.E菌株，空白组灌服等量PBS。第四天剖解两组鸡，，对每组鸡进行解剖，收集心脏、肝脏、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、胰腺和肾脏等组织。为了富集组织中细菌，每个样本取1 g加入25 mL预先准备的缓冲肽液中，富集12 h后离心10 min，沉淀用PBS重悬，用建立的夹心分析方法测定重悬液中S.E含量。并同时采用qPCR和平板培养法验证测定结果。结果表明，感染S.E后，除了胃部，几乎鸡体内所有肠道相关器官均有S.E定植（图6a）。另外发现在非肠道器官中肝脏S.E定植量最高，意味着肝脏是S.E定植及感染的高风险器官（图6b）。而心脏和肾脏中无S.E定植。建立的夹心ELISA方法检测结果与qPCR结果基本一致，与平板计数法完全一致（表2）。表2 建立的夹心ELISA方法分析S.E在鸡体内定植及与qPCR法和平板计数法结果对比

图6 检测S.E在鸡体内的定植；6a, S.E在鸡肠道器官的定植； 6b, S.E在鸡非肠道器官的定植。

小结

本研究通过噬菌体展示技术筛选了4株S.E特异性纳米抗体，并进一步与HRP融合表达。选择SE-Nb1和SE-Nb9-vHRP作为配对抗体建立了夹心ELISA方法检测S.E，牛奶中S.E检测限低至5×104 CFU/mL，另外所建立的方法可以用于分析S.E感染后在鸡体内的定植情况。这种新建立的方法具有实际应用价值，能够检测牛奶中S.E并有望用于家禽养殖业来控制食品安全。

原文出处

Kui Gu, Zengxu Song, Changyu Zhou et,al. Development of nanobody-horseradish peroxidase-based sandwich ELISA to detect Salmonella Enteritidis in milk and in vivo colonization in chicken. Journal of Nanobiotechnology. 2022, 20: 167. 

指导老师：王战辉

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