微机械力促进主动脉瓣钙化

摘 要

目的：钙化主动脉瓣疾病是一种与力相关的炎症过程。本研究的目的是确定微机械力是否能诱导猪瓣膜间质细胞的瓣膜钙化，并通过方差分析法：磁扭转细胞术检测整合素αvβ3在瓣膜钙化中的作用。

方法：体外培养猪瓣膜间质细胞，采用磁扭转细胞术对其施加微机械力。检测钙化相关因素骨桥蛋白和RUNX2的变化。通过使用钙化培养基，确定了诱导瓣膜间质细胞钙化的最佳磁扭转细胞术参数，并建立了磁扭转细胞仪钙化促进模型。通过使用αvβ3拮抗剂阻断αvβ3的功能，研究了αvβ3在钙化中的作用。

结果：逆转录聚合酶链反应检测显示，25G-1Hz刺激5分钟后再30分钟，骨桥蛋白的表达增强。Western blotting分析显示，25G-1Hz刺激5分钟后，骨桥蛋白和RUNX2的表达在24小时后上调。诱导猪瓣膜间细胞钙化的最佳磁扭转细胞仪参数为25G-2Hz，持续10分钟。在添加αvβ3拮抗剂后，桥骨蛋白和RUNX2的表达显著降低。临床上，双瓣主动脉瓣患者的主动脉瓣中RUNX2和β3的表达较高，β3与RUNX2显著相关。

结论：应用磁扭转细胞术，通过微机械力刺激建立了猪瓣膜间质细胞钙化模型，并获得了最佳参数。整合素αvβ3在主动脉瓣钙化过程中起关键作用。

钙化主动脉瓣疾病（CAVD）是美国心血管疾病的第三大病因。与正常受试者相比，患有二尖主动脉瓣（BAV）畸形的受试者的剪切力显著增加。据报道，机械应力是人类早期生物瓣膜钙化的独立决定因素涉及应变、应力和压力的一个反应过程。所有3种机械力直接作用于瓣膜内皮细胞，瓣膜间质细胞（VICs）通过细胞-细胞和细胞基质机械传导受到这些力的刺激。因此，在微环境中，VICs通过微机械力受到机械刺激。所有这些都表明机械力可能在CAVD中起重要作用。CAVD被认为是由小叶的时间依赖性磨损和被动钙沉积引起的退化过程。目前，令人信服的组织病理学和临床数据表明，CAVD是一种活跃的多方面疾病，涉及脂蛋白沉积、慢性炎症、VICs的成骨细胞转变和活动性小叶钙化。

磁扭转细胞术（MTC）可以向细胞表面受体或分子施加微机械力，而不引起整体形状变化，由Butler和Wang发明。MTC最初是为了通过磁珠向活细胞施加局部机械力，并通过量化磁珠的残余磁场来探测机械响应。MTC与通过光学记录磁头位移（图1）探测机械响应时，在1维施加微机械力的光学显微镜。与其他方法相比，MTC可用于施加大范围力频率（0-1000 Hz）的力，并同时探测许多（>100）单元，使其成为一种独特的微力机械技术。

整合素是介导细胞基质粘附受体的主要跨膜分子。整合素是一种非共价连接的异二聚体分子，含有一个α和一个β亚基。整合素可以将微机械力从细胞外基质传递到细胞。Maile和他的同事发现整合素αvβ3参与高血糖介导的猪动脉粥样硬化。Freemand和Otto表明，CAVD是一种活跃的疾病过程，与动脉粥样硬化相似，具有脂蛋白沉积、慢性炎症和活跃的小叶钙化。因此，假设CAVD不仅可能由持续的促炎反应引起，也可能由微机械力引起。此外，微机械力可由整合素传递，整合素可通过αvβ3影响猪VICs（pVICs）的钙化。

在本研究中，我们使用MTC装置对VICs施加微机械力，并检查钙化相关因素的变化。我们确定了最佳参数，建立了MTC诱导的VICs钙化模型，并研究了新模型中可能的信号通路。此外，我们收集了人类主动脉双壳畸形的样本，并对其进行了测试，以验证我们的假设。这项研究可以为我们提供更多关于微机械力及其在CAVD中的作用的信息。

材料和方法

细胞培养和处理

同济医学院动物护理委员会根据机构动物护理和使用指南批准了动物的使用和护理。成年猪（130-150kg）的心脏从当地屠宰场获得，在冷等渗盐水中转移到实验室，并立即处理。死亡后1小时内，从主动脉根部精确解剖主动脉瓣叶，并在无菌条件下用冷等渗盐水冲洗。将瓣膜在37℃的胶原酶I中消化，然后以1000 rpm离心5分钟。pVICs在37℃下在含有青霉素G、链霉素、10%胎牛血清（FBS）和5%CO2的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。还使用含有DMEM培养基、5%FBS、50ug/mL抗坏血酸、100nmol/L地塞米松和10mmol/Lβ-甘油磷酸的预钙化培养基。

精氨酰甘氨酸天冬氨酸肽包被珠子

将珠子重新悬浮在95%乙醇中，浓度为5mg/mL，用于灭菌，并在4℃下储存。然后，将200uL磁性头混合物转移到含有1.5mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）的微量试管中，然后离心1200rpm 1.5分钟。丢弃上清液，加入1mL碳酸盐缓冲液（pH=9.4）和10uL精氨酰甘氨酰天冬氨酸（RGD）肽溶液（0.5ug RGD与100mL二甲基亚砜在无菌罩中每孔混合，并在4℃下储存，最终浓度为50ug/mL）。立即使用珠子或在4℃下储存14天。

磁扭转细胞术对猪瓣膜间质细胞施加微机械力

在室温下以1200rpm离心含有RGD涂层磁珠（1mg/mL在Carbonate缓冲液中）的管1.5分钟。丢弃上清液，将珠悬浮在1mL PBS中，并以1200rpm离心1.5分钟。加入1mL PBS以制备1mg/mL的溶液。将PVICs消化并在35mm培养皿中以1.0-1.2x106个细胞培养；向粘附在细胞表面的细胞中添加4.05x106珠（待粘附细胞的数量比为1:3.3至1:4），并在37℃下用0.5%CO2孵育10分钟，以允许整合素聚集并与珠形成局灶性粘附。将细胞从培养箱中取出，并在加入含有10%FBS的DMEM后用2mL PBS冲洗两次。将培养皿放置在倒置显微镜的台上，定位附着在磁珠上的转染细胞。

珠子运动的图像分析

在确定MTC的参数（幅度、时间和频率）后，收集细胞和珠子的亮场和相位对比图像。我们使用MATLAB创建了一个定制程序，以获得珠子的位移，并计算珠子的移动比率。

实时逆转录聚合酶链反应

如前所述，分离RNA并反向转录成互补DNA。在StepOnePlus实时PCR系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上，使用SYBR Premix Ex Taq（日本大津Takara Bio Inc）进行实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析。OPN和RUNX2的PCR引物序列如表1所示。将结果归一化为GAPDH表达，并通过比较循环阈值（实时RT-PCR数据）方法进行分析。

Western blotting分析

如前所述，将细胞匀浆并进行Western blotting分析。针对以下蛋白质的一级抗体使用GAPDH、BMP2、OPN（所有稀释度1:1000）；RUNX2和β3（两种稀释度均为1:200）。GAPDH用作总蛋白与胞浆蛋白测定的标准化培养基。使用QuantityOne软件通过密度测定法对条带进行量化。

Hoechst碘化丙啶染色法检测细胞凋亡

在向细胞中加入Hoechst染料溶液和碘化丙啶染料溶液后，使用荧光显微镜评估以下情况：活细胞显示较少的蓝色和红色；凋亡细胞呈强蓝色和弱红色；坏死细胞呈现弱蓝色和强红色。

患者选择和样本采集

本研究符合赫尔辛基宣言，并于2018年2月27日获得协和医院和同济医学院评审委员会的批准（IORG编号：IORG0003571）。获得所有患者的知情同意。我们从协和医院收集了患者信息、检查结果和血液检测结果。我们包括接受主动脉瓣置换术（AVR）的BAV患者（n=30）。对照组为急性主动脉夹层合并主动脉瓣置换术的患者，其瓣叶形态正常（n=30）（见视频1）。排除风湿性疾病和感染性心内膜炎患者。所有患者均由经验丰富的心电图仪检查。

免疫组化

如前所述进行免疫组织化学染色。制备石蜡切片（5mm）并在室温下干燥2小时。将切片与抗RUNX2（稀释度1:50）和整合素αv（稀释度1:1000）和β3（稀释度1:2000）的抗体一起孵育，然后用生物素缀合的过氧化物酶技术孵育。

茜素红染色

如前所述，对钙沉积物进行茜素红染色。首先，用PBS洗涤pVICs两次，并在4%多聚甲醛中固定15分钟。用0.2%茜素红溶液孵育30分钟后，用蒸馏水洗涤除去多余的染料。

统计学分析

所有数据均使用SPSS 17.0版进行分析，图片由GraphPad Prism 5 8.0版软件绘制。符合Shapiro–Wilk检验的正态分布的变量表示为平均标准差，如果不是正态分布，则表示为中值和四分位间距。2个正态分布变量组之间的差异通过Studentttest进行评估，多个组通过单向方差分析和Tukey事后分析进行评估。通过Wilcoxon秩和检验比较2个非正态分布数据之间的差异，通过Kruskal–Wallis H检验比较多个组。卡方检验用于分类变量之间的差异。我们使用皮尔逊相关分析进行线性模型。

结果

磁扭转细胞术对猪瓣膜间质细胞作用的微机械力

我们收获了如上所述培养的pVICs。在一组中，磁珠与RGD混合并添加到pVICs中；在另一组中，只有珠被直接添加到pVICs中（图2，A）。我们可以在显微镜下看到附着在前列腺癌表面的磁珠的形状（图2，A）。我们发现RGD涂层珠的位移（nm）和均方距离（MSD）（nm2）都显著小于未涂层珠。我们使用MATLAB计算珠子的位移和MSD（图2，B）。我们发现RGD涂层和未涂层磁珠的位移和MSD存在显著差异（P<0.0001，图2，C，128.77 ±8.07 vs 12.33±1.13；图2，D，24608[22287.63-25756.05]vs 141[132.43-153.61]）。这些数据表明，磁珠在磁场力学作用下发生了相对运动。加入RGD肽后，磁珠的运动轨迹明显变小，表明包被的磁珠通过RGD肽与VICs表面结合，并在VICs上持续施加微机械力。

微机械力诱导猪瓣膜间质细胞成骨分化

为了研究微观机制是否能诱导pVICs的成骨分化，我们分为两组。在对照组中，仅添加包被磁珠，而在实验组中，添加包被磁珠并使用常用参数（F＝25G，T＝5分钟）向活细胞施加MTC力。我们用1Hz来模拟心跳的频率。因此，使用25G-1Hz，持续5分钟。为了分析不同组中基因表达水平的变化，进行了定量实时RT-PCR。RT-PCR分析显示，只有OPN在刺激5分钟后30分钟显著增加（P<0.05，1.01±0.07 vs 1.38±0.09），而其他钙化因子与非微力组相比在统计学上保持不变（均P>0.05）（图3，A）（表2）。蛋白质印迹分析表明，与非微力组相比，刺激后24小时，RUNX2和OPN的表达显著增加（P<0.01，1.02±0.07 vs 1.51±0.20）（图3，B）。这一结果表明，微机械力可以影响pVICs的成骨分化。为了探讨力和频率对VIC钙化的影响，我们将VIC分为5组：对照组（0G-0Hz）、25G-1Hz、25G-2Hz、50G-1Hz和50G-2Hz组。蛋白质印迹分析显示，在刺激5分钟后的24小时，所有微力组的OPN显著增加（所有P<.01，25G-1Hz vs 25G-2Hz，1.72±0.09 vs 2.68±0.17，50G-1Hz vs 50G-2Hz、1.66±0.18 vs 2.63±0.21，25G-1Hz vs 50G-1Hz，1.73±0.09 vs.2.63±0.21）（图3，C）（表2），而RUNX2仅在25G-2Hz和50G-2Hz组中显著增加（均P<0.05，25G-2HHz，1.00±0.07 vs 2.49±0.25，50G-2Hz，1.00±.07 vs 2.11±0.43），但F=50G的结果与F=25G相比无差异（P＞0.05）（表2）。总的来说，我们的数据显示，微美？机械力诱导的pVICs和OPN的成骨分化立即直接增加。数据表明，微机械力可以诱导pVIC钙化，并且微机械力的大小和频率对pVIC的钙化很重要。

诱导猪瓣膜间质细胞钙化的最佳磁扭转细胞测定参数

为了确定最佳MTC参数，我们使用25G-2Hz进行不同的持续时间，并在条件培养基（CM）下培养24小时后进行蛋白印迹技术。当MTC应用于不同的持续时间时，我们发现当T=10分钟时，Runx2显著增加（P<.05，1[0.95-108]vs 1.87[1.68-2.40]）。当持续时间增加时，Runx2的表达不变（图4，A）。因此，最佳时间为10分钟。接下来，我们将力集中在2Hz，持续10分钟。我们施加了0、6.25、12.5、25、50或100G的力。当应用25G时，Runx2显著增加（P<0.05，1.05±0.07 vs 1.99±0.34）（图4，B）。然后，我们重点关注F=25G和t=10分钟时的频率。我们使用的频率为0、0.5、1、2或3 Hz。当f=2Hz时，Runx2显著增加（P<0.05，1.02±0.06 vs 1.48±0.28）（图4，C）。我们在pVIC上施加25G-2Hz的力10分钟，并将细胞在CM中培养不同的时间。培养24小时或48小时后，RUNX2和OPN均发生显著变化（P<0.05，24小时，1.00±0.06 vs 1.43±0.25；48小时，1.00±0.06 vs 1.76±0.29）（图4，D）。为了检测微力是否会损伤活细胞并导致细胞过度死亡，我们进行了细胞凋亡实验；施加25G-2Hz 10分钟，并培养pVIC 72小时。结果表明，MTC组与对照组无差异（P>0.05）（图4，E）。这表明25G-2Hz的力持续10分钟可以有效地诱导pVIC钙化。

整合素αvβ3在机械化学转导中的作用

整合素受体在机械化学转导中的作用是众所周知的。为了区分是整合素受体还是简单的机械功能，我们进行了以下实验。我们使用聚-L-赖氨酸（PLL）代替RGD涂覆珠。PLL不附着细胞表面的整合素受体，仅通过范德华力附着细胞。在施加25G-2Hz的力10分钟后，将这些细胞培养24小时。蛋白质印迹技术显示对照组和PLL组之间OPN和RUNX2水平没有差异（图5，A）。整合素αvβ3在机械化学转导中的作用已经被其他领域的其他研究人员讨论过。因此，我们有兴趣进一步探索整合素αvβ3是否能介导pVICs成骨分化中的微机械力。为了阻断αvβ3受体，我们使用了特异性αvβ3拮抗剂。我们在加入RGD包被珠之前约2小时向pVICs中加入αvβ3拮抗剂。然后，施加25G-2Hz的力10分钟。将pVIC在CM中培养24小时后，我们检测OPN和RUNX2的蛋白表达。

阻断整合素αvβ3后，OPN和RUNX2的蛋白表达显著降低（P<0.05 RUNX2，1.00±0.05 vs 0.76±0.05；OPN，1.02±0.07 vs 0.71±0.12）（图5，B）。培养14天后，茜素红染色显示抑制剂组钙化结节显著减少（图5，C）。总之，整合素αvβ3可能参与pVICs成骨分化的微机械力。为了研究整合素αvβ3，我们在没有MTC的情况下再次重复该实验：使用正常培养基的对照组、使用CM的CM组和使用αvβ3拮抗剂的CM t拮抗剂组。我们发现，αvβ3拮抗剂显著降低了RUNX2和OPN的表达（P<0.05，对照组vs CM，1.00±0.06 vs 1.5±0.15；CM vs CM t拮抗剂，1.51±0.15 vs 0.76±0.21；OPN，对照组vs CM，0.98±0.06 vs.1.51±0.18，CM vs CM t拮抗剂，1.5±0.18 vs 1.16±0.16）（图5，D），14天后，茜素红染色显示出类似的结果（图5、E）。

整合素αvβ3在双尖主动脉瓣患者中的表达

为了证实我们关于整合素αvβ3的假设，我们收集了联合医院接受主动脉瓣置换术的BAV患者和急性主动脉夹层合并主动脉瓣置换手术（三尖瓣主动脉瓣）患者的数据。患者数据汇总在表3中。BAV组和正常组（无BAV患者）在年龄和体重指数方面存在显著差异（表3）；两组在性别、血脂水平和血清肌酐浓度方面没有差异。免疫组织化学染色显示，RUNX2在BAV组中的表达明显高于正常组，表明BAV组比正常组有更多的钙化。然后，我们使用免疫组织化学染色和蛋白质印迹来确定b3表达是否改变。免疫组织化学染色和蛋白质印迹表明，BAV组RUNX2和β3的表达更高，RUNX2和b3的表达彼此显著相关（P<0.05，r=0.539），而αv保持不变（P>0.05）（图6，A）。免疫荧光显示，钙化组β3的表达显著高于正常组，但αv无显著差异（图6，B）。此外，RUNX2和β3的表达彼此显著相关（P<0.05，r=0.521）（图6，C）。这些结果提示整合素αvβ3可能在BAV患者的瓣膜钙化中起重要作用。

讨论

在这项研究中，我们发现MTC可以对pVIC施加精确的微机械力。此外，MTC刺激后早期OPN快速增加，这比其他钙化相关因素如RUNX2、BMP2和ALP更快。此外，我们证明25G-2Hz持续10分钟是pVIC钙化的最佳选择。我们使用该参数治疗pVIC并培养它们14天。MTC组的茜素红染色显著增加，我们成功地建立了一个新的MTC模型，通过施加微机械力促进pVIC钙化。在这个新的MTC模型中，我们发现αvβ3拮抗剂减少了pVICs的钙化。最后，我们测试了患者的瓣膜，发现主动脉瓣上的整合素αvβ3在BAV患者中高度表达，整合素β3的表达与钙化蛋白RUNX2呈正相关（图7）。

先前的研究表明，CAVD与机械刺激有关，特别是在BAV患者中。BAV血流动力学已成为BAV钙化的潜在病因。由于有限的实验条件和获得临床标本的困难，许多研究人员关注生物瓣膜钙化问题。因为人工瓣膜钙化是不可避免的，它肯定与压力刺激有关。以前的模型只能对小叶施加宏观机械力。Balachandran及其同事提出，拉伸的机械变化会导致退行性主动脉瓣疾病。它们不能对单个活细胞施加微机械刺激，这些模型也不能探索机械化学转导中的受体，因为它们对整个细胞施加力，这会导致全局形状变化，而不仅仅影响特定的受体。

MTC于1996年发明，可以直接向细胞表面受体施加微机械力，而不会引起整体形状变化。在磁场的作用下，磁珠可以通过RGD肽和整合素受体向细胞传递力刺激。整合素可以将力从细胞外基质传递到细胞，RGD包被的磁珠可以通过整合素与细胞结合。通过使用MTC，Tajik和同事发现，施加到整合素上的微机械力通过纤层染色质相互作用从拉紧的肌动蛋白细胞骨架传播到LINC复合体，直接拉伸染色质，然后上调相关蛋白的转录。因此，我们可以得出结论，整合素可以介导pVICs成骨分化中的微机械力。整合素α1β1和α2β1在成骨细胞钙化中起作用。当成骨细胞（需要BMP2活化）刚刚融合时，添加整合素亚基α1和α2的中和抗体可以部分降低成骨细胞ALP活性和钙化。整合素αv在人类牙髓干细胞钙化中起作用。整合素亚基αv小干扰RNA干扰牙髓干细胞在硅酸钙表面的生长，并可减少钙结节的形成。据报道，我们研究的αvβ3亚型参与了人类主动脉动脉粥样硬化，这与我们对pVICs的研究结果一致。

在本研究中，我们成功地建立了一个新的MTC模型，以应用微机械力促进pVIC的钙化。结果表明，OPN的增加比其他人更早，这表明机械力可以通过细胞骨架直接影响基因表达。我们进一步使用整联蛋白αvβ3拮抗剂阻断整联蛋白αvβ3，使得RGD肽只能与其他整联蛋白受体如α5β1、αvβ6和α8β1结合。阻断整合素αvβ3后，OPN和RUNX2的蛋白表达降低。总之，我们发现整合素αvβ3可以介导pVICs成骨分化中的微机械力。我们发现BAV组主动脉瓣上整合素αvβ3高度表达，整合素b3的表达与钙化蛋白RUNX2呈正相关。MTC模型只能用于研究细胞的微观力学力函数。它不能用于研究组织或身体。

研究局限性

首先，本研究中钙化标记物有限。第二，钙化和整合素αvβ3之间的信号通路需要进一步研究。第三，我们目前无法使用微观磁力来完全模拟血流动力学宏观力。力的类型和力的持续时间不能模拟持续数年的实际生理力。在未来，也许我们有能力将宏观机械刺激转化为我们可以控制的微观刺激。

结论

MTC为研究心脏病中的细胞力提供了一种新的途径。在未来，我们可以使用这种方法来研究早期心脏瓣膜钙化过程中的微观力以及该力如何影响CAVD。

翻译及审校：孙铧 张滢 

图1。MTC的基本磁性原理图。

A、 MTC的基本结构，包括磁化线圈、扭转线圈和平台。

B、 当磁场发生时，力作用在珠子上并触发珠子，如位移所示。

C、 细胞表面的珠子。磁场发生前后的磁珠轨迹。MTC、磁扭转细胞术。

图2。在包封RGD肽之前和之后磁珠的不同运动状态。

A、 当珠被RGD肽包被时，许多珠粘附到细胞表面。无涂层时，仅附着少量珠子。

B、 珠子附着在细胞表面。放大倍数，4003。

C、 当珠被RGD肽涂覆和未涂覆时，每个磁珠在磁场下的最大位移显著不同***P<0.001。

D、 当珠被RGD肽包被和未包被时，每个珠的MSD差异显著***P<.001。

方框的上下边界表示上下四分位数。中间的水平线表示中间带。上胡须和下胡须表示非凸耳的最大值和最小值。每组N=16。RGD，精氨酰甘氨酰天冬氨酸；MSD，均方距离。

图3。微机械力诱导pVICs的成骨分化。

A、 在对照组中，仅向pVIC中添加涂覆的珠粒，而在实验组中，向pVICs中添加涂覆有RGD的珠粒并向细胞施加MTC力（25G-1Hz 5分钟）。刺激5分钟后？进行RT-PCR。测试Opn、Runx2、Alp和Bmp2。只有opn显著增加（*P＜0.05），其他没有（P＞0.05）。

B、 对照组和实验组与A组相同。刺激5分钟并用标准培养基培养24小时后，进行Western blotting，结果显示OPN和RUNX2均显著增加（均P<0.05）。

C、 在5组中，对照组保持不变；4个实验组分别为25G-1Hz 5分钟、25G-2Hz 5分钟、50G-1Hz 5分和50G-2Hz 5分钟。在不同的参数下，OPN和RUNX2的蛋白质印迹表达不同。对于OPN，所有具有微力的组均显著增加（所有*P<.05）

（C） ；对于RUNX2，只有25G-2Hz和50G-2Hz组显著增加（*P<0.05）。方框的上下边界表示上下四分位数。中间的水平线表示中间带。上胡须和下胡须表示非凸耳的最大值和最小值。每组N=9。

mRNA、信使RNA；OPN、骨桥蛋白；RUNX2、runt相关转录因子2；碱性磷酸酶；Bmp2、骨形态发生蛋白2；GAPDH、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

图4.识别诱导pVIC钙化的最佳MTC参数

A ，我们固定了25G-2Hz，并设置了4个不同的持续时间组：5分钟、10分钟、15分钟和20分钟。在T=10分钟时，结果显著增加（*P<0.05）。

B、 我们固定了2Hz 10分钟，设置了5个不同的力值组：6.25G、12.5G、25G和50G。当F=25G时，其显著增加（*P<0.05）。

C、 我们固定了25G 10分钟，并设置了4个不同的频率组：0.5 Hz、1 Hz、2 Hz和3 Hz。当f=2Hz时，其显著增加（*P<0.05）。

D、 我们用25G-2Hz刺激10分钟，培养4小时、12小时、24小时、48小时和72小时；对于RUNX2，24小时和48小时均显著增加（均*P<.05），而对于OPN，12小时、24小时和24小时均显著提高（均*P<.05）。

E、 对照组保持不变，而我们在实验组中用25G-2Hz刺激细胞10分钟。刺激10分钟后，将细胞培养72小时。我们检测到pVIC凋亡，因为活细胞的蓝色和红色荧光较少；凋亡细胞具有强蓝色和弱红色荧光；坏死细胞具有弱蓝色和强红色荧光。我们发现，两组的蓝色信号没有显著差异，两组几乎没有发现红色信号。

CM用于A至E实验。方框的上下边界表示上下四分位数。中间的水平线表示中间带。上胡须和下胡须表示非凸耳的最大值和最小值。A-D中每组N=9；对于E，n=7。

RUNX2，Runt相关转录因子2；GAPDH、甘油醛-3-磷酸脱氢酶；OPN、骨桥蛋白。

图5。整合素avb3在体外机械化学转导中的作用。

A、 在对照组中，我们只向pVIC添加了珠子。在实验组中，我们将PLL和珠子添加到pVIC中。我们施加25G-2Hz微机械力10分钟，培养pVIC 24小时。Western blotting显示对照组和PLL组之间OPN和RUNX2无差异（P>0.05）。

B、 对照组具有RGD包被的带有pVIC的珠粒。实验组使用特异性avb3拮抗剂阻断受体，我们在加入RGD包被珠之前约2小时将拮抗剂加入pVICs。Western blotting显示OPN和RUNX2的表达显著降低（*P<0.05）。

C、 对照组和实验组与B组相同。培养14天后，茜素红染色显示实验组钙化结节明显减少。

D、 我们将对照组设为正常培养基，CM组设为CM，CM t拮抗剂组设为avb3拮抗剂，发现添加avb3阻断剂时RUNX2和OPN的Western blotting表达显著降低（*P<0.05）。

E、 14天后，茜素红染色显示，当添加avb3拮抗剂时，钙结节显著减少。CM用于C到E实验。方框的上下边界表示上下四分位数。中间的水平线表示中间带。上胡须和下胡须表示非凸耳的最大值和最小值。每组N=9。

OPN，骨桥蛋白；RUNX2、runt相关转录因子2；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；PLL，树枝状聚-L-赖氨酸；MTC、磁扭转细胞术；CM，条件培养基。

图6。BAV患者整合素avb3的表达。

A、 正常（非BAV）和BAV的免疫组织化学染色显示，BAV组RUNX2和b3的表达更高，RUNX2和b3的表达彼此显著相关（*P<0.05，r=0.539），而av保持不变（P>0.05）。

B、 av和b3的免疫荧光。蓝色表示DAPI，红色表示av，绿色表示b3，箭头表示合并。

C、 正常和BAV中RUNX2、av和b3的蛋白质印迹，BAV组中b3和RUNX2均增加。b3和RUNX2彼此显著相关（*P<.05，r=0.521）。方框的上下边界表示上下四分位数。中间的水平线表示中间带。上下搅拌器代表非输出的最大值和最小值。A=14，C=12。

BAV，二尖主动脉瓣；RUNX2、runt相关转录因子2；DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚；GAPDH、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

图7。描述了文章的基本内容。

MTC装置提供微机械刺激以刺激细胞表面的整合素受体avb3，并调节细胞中OPN和RUNX2的基因合成和蛋白质表达，最终导致瓣膜钙化。蓝色方框简要描述了实验的方法、结果和意义。

MTC、磁扭转细胞术；OPN、骨桥蛋白；RUNX2、runt相关转录因子2；pVIC、猪瓣膜间质细胞；RT-PCR、逆转录聚合酶链反应；WB、蛋白质印迹技术；IHC，免疫组化；CAVD，钙化主动脉瓣疾病。

表1。用于实时逆转录聚合酶链反应的引物

表2。所有数据的定量比较

表3。选定患者的临床特征

分类变量表示为构成比（%），卡方检验用于分类变量之间的差异。数值变量表示为平均值±标准偏差，并通过Student t检验进行评估。

BAV，二尖瓣主动脉瓣；BMI，体重指数；NS，不显着；LDL，低密度脂蛋白；HDL，高密度脂蛋白。

END