钠-葡萄糖共转运蛋白2的抑制抑制肾结石形成

背景和目标： 肾结石是一种常见的肾脏疾病，没有有效的药物。钠-葡萄糖共转运蛋白-2（SGLT2）抑制剂是一种抗糖尿病药物，具有利尿和抗炎特性，可以预防肾结石。在这里，我们使用大规模的流行病学数据、动物模型和细胞培养实验研究了SGLT2抑制肾结石的潜力。

方法： 这项研究包括日本行政数据库中可用的糖尿病患者数据（n = 1，538，198），并根据SGLT2抑制剂处方状态对其进行划分。对于动物实验，在Sprague-Dawley大鼠中，乙二醇诱导肾草酸钙结石，并使用根皮苷（SGLT1 / 2抑制剂）进行治疗。在SGLT2缺陷小鼠和人近端肾小管细胞系HK-2中评估SGLT2特异性抑制肾结石形成的影响。

结果： SGLT2 抑制剂处方组糖尿病男性肾结石患病率显著低于非 SGLT2 抑制剂处方组。根皮苷减轻了大鼠肾结石的形成，并下调了肾损伤分子1（Kim1）和骨桥蛋白（Opn）的表达，而饮水量和尿量保持不变。它抑制炎症和巨噬细胞标志物表达，表明SGLT2抑制剂在减少炎症中的作用。SGLT2缺陷小鼠对乙醛酸诱导的草酸钙结石形成具有抗性，Opn表达降低和肾损伤。高葡萄糖诱导的OPN和CD44上调以及HK-2细胞中SGLT2沉默后草酸钙的细胞表面粘附降低。

结论： 总体而言，我们的研究结果发现SGLT2抑制可防止肾结石形成，并且可能是治疗肾结石的有希望的方法。

重点

•SGLT2抑制剂可减少基于日本数据库的糖尿病男性肾结石。

•根皮苷改善肾CaOx结石的形成，以及随后对大鼠的损害。

•SGLT2缺乏抑制小鼠的肾CaOx结石，炎症和损伤。

•SGLT2沉默在体外抑制OPN上调和CaOx晶体细胞粘附。

•SGLT2抑制剂可能是治疗肾结石的一种有希望的治疗方法。

肾结石（肾结石）是全世界最常见的疾病之一，经常引起急性疼痛并恶化肾功能。它偶尔也会发展为尿路感染和脓毒症，这可能是致命的。在美国，肾结石是医疗保健中最昂贵的泌尿系统问题，每年花费超过100亿美元[1]。其终生患病率在男性中约为10%，在女性中约为6%，并且在许多发达国家中呈上升趋势[2]，[3]。此外，其复发率在5年内为30-40%，在10年内为50%[4]。大多数肾结石是草酸钙（CaOx）结石[3]，[4]。虽然内镜下手术切除肾结石可以以最小的侵入性进行，但对于CaOx结石仍然没有有效的预防或治愈药物[5]，[6]，[7]，因此需要更好地了解该疾病的分子机制。

钠-葡萄糖共转运蛋白-2（SGLT2，由SLC5A2编码）抑制剂是一类新型的抗糖尿病药物，通过抑制近端小管S1和S2段的SGLT2来诱导尿葡萄糖排泄[8]，[9]。除血糖控制外，SGLT2抑制剂还具有多种功能，包括降低血压[10]、改善心血管结局[11]、肾保护[12]、[13]、[14]、改善脂质以及降低体重、内脏脂肪和血清尿酸水平[15]，[16]。此外，SGLT2抑制剂通过改善心肌能量[17]，[18]，[19]引起反向心脏重塑，并降低主动脉硬度[20]，同时提高生活质量[21]。SGLT2抑制剂的功能机制多种多样，包括利尿和抗炎作用[12]，[22]。

包括OPN在内的炎症因子对肾结石至关重要[23]，[24]，[25]，[26]，[27]，[28]。OPN是从肾小管细胞分泌的多效性糖蛋白，也是钙结石基质中最重要的晶核蛋白之一[23]，[24]，[25]。SGLT2抑制剂抑制近端小管OPN的产生[29]，可预防CaOx肾结石。然而，SGLT2抑制剂对肾结石的治疗潜力在人类中存在争议[30]，[31]，需要更详细地研究。

因此，我们假设SGLT2抑制剂可能是治疗肾结石的潜在治疗方法。为了验证这一假设，我们进行了一项大规模的流行病学研究，以评估肾结石患病率与SGLT2抑制剂处方状态之间的关系。我们还研究了SGLT2抑制对动物模型和人细胞培养实验中CaOx肾结石的影响。

在这项研究中，我们描述了SGLT2抑制对肾结石的影响。我们使用日本急性DPC医院数据库确定SGLT2抑制剂对糖尿病男性肾结石有效。此外，在EG诱导的肾CaOx结石形成的大鼠中，根皮苷治疗对肾结石形成和随后的肾损伤有效，而不影响饮水量，尿量和草酸盐排泄。SGLT2抑制的这种有益作用在SGLT2缺陷小鼠中得到复制。此外，SGLT2沉默抑制了人HK-2近端肾小管细胞系中高葡萄糖引起的OPN和CD44 mRNA上调和CaOx晶体细胞粘附。

尽管SGLT2抑制剂具有多种功能[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，但其对肾结石的影响的报告并不一致[30]，[31]。一篇meta分析纳入了SGLT2抑制剂随机临床试验，结果显示SGLT2抑制剂不影响肾结石的风险[30]。然而，这项研究的样本量有限，因为肾结石不是纳入试验中预先指定的终点，而且肾结石发病病例数很少。相比之下，一项使用丹麦卫生登记处的全国性队列研究显示，SGLT2抑制剂使用者发生肾结石的风险低于DDP4抑制剂使用者[31]。这项研究推测，SGLT2抑制剂增加的尿量可能是其对肾结石具有保护作用的一个原因。此外，一项临床试验已启动，以验证SGLT2抑制剂恩格列净预防肾结石事件的效果[63]。SGLT2抑制剂的一些病理生理功能，如尿pH升高、尿量增加和抗炎作用[12]，[22]，[39]，[40]，[41]，[42]，表明可能对肾结石具有保护作用;但是，尚未审查详细的机制。

在自由饮用水中使用EG的肾CaOx结石形成大鼠模型已经建立，并作为临床肾结石形成模型而不是简单的实验模型进行研究，因为该模型没有显示严重的肾损伤[34]，[35]。适当浓度的EG给药导致CaOx在肾小管细胞表面蓄积，而其他代谢中间体对肾细胞无毒[35]，[64]。然而，由于SGLT2抑制剂的利尿作用，特别是在急性期，可能是常规利尿剂的加用[12]，[22]，[39]，[40]，[41]，[42]，[43]，[44]，[45]，我们假设EG过量可能形成过多的肾结石和器官毒性。 因此，我们将EG的给药程序从与水混合修改为体重参考皮下注射。通过皮下注射EG以及用饮用水给药在大鼠中形成肾结石。此外，大鼠[65]和小鼠[66]品系的水摄入量各不相同。因此，通过皮下注射精确和准确的剂量可能会导致结石形成模型的稳定和药物治疗（包括利尿剂）的适当评估。

SGLT2抑制抑制近端小管炎症，防止CaOx结石形成以及随后的损伤和纤维化。然而，尽管SGLT2抑制剂的利尿/利钠作用是常规利尿剂的加和，在急性期放大，在人类慢性期减轻，但未观察到EG诱导的肾CaOx结石形成（EG与EG + Ph）大鼠的尿量和饮水量有显着影响[43]，[44]，[45]。.与利尿作用相反，SGLT2抑制抑制结石核心基质蛋白OPN的表达以及肾损伤，炎症和巨噬细胞的标志物。这些表型在乙醛酸诱导的SGLT2缺陷小鼠的肾CaOx结石形成模型中和体外人近端肾小管上皮细胞研究中重复。从这些结果中，我们提出SGLT2抑制肾CaOx结石形成的有益作用可能是由于其抗炎作用。

SGLT2抑制剂还可降低血清尿酸水平，并通过改变与糖尿相关的尿酸转运活性来增强尿酸排泄[67]，[68]，[69]。虽然血清尿酸降低通过改善主动脉硬度[20]和降低炎症小体活性[70]而有益于生活质量，但高尿酸血症是肾尿酸结石形成的风险[71]。在这项研究中，根皮苷治疗倾向于降低血浆尿酸并增加尿酸水平。虽然尚未报道SGLT2抑制剂与肾尿酸结石之间的关系[63]，[71]，但不能排除SGLT2抑制增加肾尿酸结石形成的风险。

晶体沉积与肾细胞损伤、细胞丢失、炎症和纤维化有关[72]，[73]。肾晶体，包括CaOx，在肾细胞中诱导活性氧介导的炎症。因此，靶向炎症可有效治疗肾结石[26]。浸润的肾巨噬细胞可促进CaOx肾钙质沉着症患者的纤维化[28]。我们发现CD68巨噬细胞浸润在间质纤维化周围，SGLT2抑制减弱了这种浸润。此外，在SGLT2被肾小管损伤抑制之前，OPN（一种与巨噬细胞反应相关的促炎细胞因子）[59]的水平升高。+

关于OPN在尿路结石形成中的作用，存在两种相互矛盾的假设：作为诱导剂[23]，[24]，[25]，[26]，[27]，[28]和抑制剂[74]，[75]。N末端OPN片段是引发病理变化的主要活性形式OPN，包括促炎作用[53]，[54]。除了是一种促炎细胞因子外，它还是在肾脏中形成CaOx晶体的最重要的核心蛋白之一[23]，[24]，[25]。OPN的总敲除或钙结合位点突变改善乙醛酸诱导的CaOx晶体在小鼠肾脏中的沉积[24]，[25]。通过表达OPN反义[76]或OPN中和抗体[77]，CaOx晶体在肾小管细胞系中的沉积减少。在体外和体内肾钙结晶的初始过程中均检测到OPN在肾小管细胞中的强表达[78]。环孢素A通过灭活亲环素D阻断线粒体通透性过渡孔开口，从而抑制OPN表达和肾结晶[78]。综上所述，我们的结果表明OPN是肾结石形成的诱导剂。此外，SGLT2抑制剂通过抑制受损近端肾小管上皮细胞的葡萄糖摄取来抑制OPN的产生，从而将代谢途径转移到糖酵解系统[29]。然而，连接葡萄糖耗竭和OPN转录活性的精确细胞内机制尚不清楚。草酸盐和钙对线粒体功能的改变导致能量产生、氧化应激调节和细胞内钙稳态以及炎症级联反应[79]。此外，近端肾小管细胞的能量代谢重编程从脂肪酸氧化到受损近端小管中的糖酵解可能有助于OPN的转录激活，因为几种细胞内途径，如哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）、AMP活化蛋白激酶（AMPK）和沉默信息调节器1（SIRT1），参与这种重编程[80]。.需要进一步的研究来辨别SGLT2抑制剂对OPN的转录调控。在培养的心脏或真皮成纤维细胞中，TGFB1介导的纤维化信号传导和肌成纤维细胞分化也需要OPN[60]。因此，SGLT2抑制OPN可有效对抗肾CaOx结石形成。

我们还发现CaOx结石形成后受损近端小管中的SGLT2表达降低。肾小管损伤与转运蛋白的丧失有关，包括SGLT2[58]。因此，SGLT2抑制的影响可能仅限于受损的近端小管。然而，SGLT2抑制剂对慢性肾脏病患者[14]和缺血再灌注肾损伤发作后开始的小鼠[57]也具有肾保护作用。在急性肾损伤期间，近端小管的葡萄糖代谢发生改变[81]，SGLT2抑制显著降低了葡萄糖摄取[57]。此外，根皮苷和SGLT2抑制剂由于抑制Na-H交换剂活性和近端小管中碳酸氢盐重吸收而增加尿pH值[82]，[83]，[84]。在这项研究中，EG给药降低了尿液pH值，根皮苷治疗提高了尿液pH值。这可能会影响CaOx晶体对管状表面的粘附，因为最高的CaOx晶体-细胞粘附性已被证明发生在酸性最强的pH值下[37]。总的来说，这些报告和我们的数据表明SGLT2抑制在肾结石发展后的应用潜力;然而，需要进一步调查以探索这一方面。++

这项研究有一些局限性。首先，日本DPC数据库中缺乏有关糖尿病严重程度和SGLT2抑制剂给药持续时间的详细信息。因此，未来需要研究SGLT2抑制剂对不同种族和无糖尿病患者的肾结石的影响。其次，在动物实验中，我们仅评估了肾CaOx结石的形成，其约占人肾结石的75%[85]。SGLT2抑制对其余25%由羟基磷酸钙、磷酸铵镁、尿酸盐或胱氨酸组成的结石的影响仍有待研究。第三，我们在大鼠实验中开始根皮苷治疗与EG给药同时进行。SGLT2抑制剂的治疗期对于在肾结石发展后通过利尿或抗炎评估其治疗潜力很重要。

5. 结论

SGLT2抑制可防止肾结石形成和随后的肾损伤。这种效应可能是由于SGLT2通过抑制近端小管中葡萄糖摄取而降低OPN基因表达和炎症（补充图13）。因此，使用SGLT2抑制剂可能是治疗肾结石的一种有希望的治疗方法。

图 6.SGLT2沉默抑制肾草酸钙（CaOx）结石形成相关基因的葡萄糖响应性上调和HK-2人肾近端肾小管细胞中的CaOx晶体粘附。（A）在高葡萄糖（25mmol/L）或低葡萄糖（5.6mmol/L）培养基中培养的HK-2细胞中SGLT2，TGFB1，OPN和CD44的相对mRNA水平。mRNA水平标准化为GAPDH，PPIA和PGK1的水平。n = 每组 6 个。（B）左：HK-2细胞不同条件下贴壁CaOx一水合物（COM）晶体的代表性显微照片。右：粘附COM晶体的定量。每组n = 20（来自四个独立实验的每个培养孔五个随机字段）。比例尺 = 100 μm。数据以单个值和平均值表示±SEM。* P < 0.05， * * P < 0.01， ns：不显著 （P > 0.05） 通过 Steel-Dwass 测试。A.U.，任意单位。

Anan G, Hirose T, Kikuchi D, Takahashi C, Endo A, Ito H, Sato S, Nakayama S, Hashimoto H, Ishiyama K, Kimura T, Takahashi K, Sato M, Mori T. Inhibition of sodium-glucose cotransporter 2 suppresses renal stone formation. Pharmacol Res. 2022 Dec;186:106524. doi: 10.1016/j.phrs.2022.106524. Epub 2022 Oct 28. PMID: 36349594.

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