少而精：CAR-T的简化设计和可控调节新思路

尽管CAR-T在肿瘤免疫治疗中表现出色，但疗效和安全性的问题仍未解决。增加治疗效果的同时减少毒副作用成为下一代CAR-T设计的目标。  实现这一目标的一个策略是条件性启动基因调控回路促进增强T细胞活性的辅助分子的表达。  通常需要转入多个病毒载体分别表达CAR元件和辅助分子，但这也会导致不受控制的细胞应答和CAR-T细胞异质性问题。基于此，Smole等研究人员开发了一种整合了肿瘤抗原诱导辅助分子表达和CAR组成型表达的单一慢病毒载体：  Uni-Vect。  在体内的治疗应用中，该系统可以以T细胞激活依赖的方式表达：增强CAR-T疗效的细胞因子IL-12、减轻细胞因子风暴的anti-IL-6受体抗体、调节T细胞活性的转录因子，从而提升CAR-T细胞的功能和安全性。    

装载不同武器的Uni-Vect系统

01  简介  

CAR-T疗法的临床疗效受到免疫抑制和T细胞功能紊乱以及细胞因子风暴的限制。通过在T细胞上表达辅助分子会增加T细胞功能，但是组成型表达辅助分子往往会导致系统性毒副作用和CAR-T细胞的恶性转化。为解决以上问题，当前的一种CAR-T设计思路是通过人为引入基因调控环路来诱导表达辅助分子以增强T细胞生物学功能并减少毒副作用。传统方法是用两个病毒载体分别表达组成型表达的CAR元件和可诱导表达的辅助分子。但两个慢病毒载体会导致CAR-T细胞异质性，因此增加了细胞分选的成本和限制了其转化应用。Smole巧妙的在T细胞中引入依赖TCR激活的转录因子NFAT这一基因调控环路来诱导表达辅助分子。研究人员将辅助分子的表达和CAR原件整合在单一载体上并在体内验证该系统的实际效果。

02  基因环路诱导表达辅助因子  

CAR-T中引入人工基因环路可以实现通过自定义的输入信号调控特异的细胞信号输出。例如，合成型Notch受体系统通过将CAR受体和Notch跨膜区以及胞内段转录因子融合为一个复合体，在synNotch受体识别肿瘤抗原之后转录因子(TF)被水解入核启动一些定制化辅助分子的表达。这种基因环路的响应依赖TCR对肿瘤抗原的识别(图1)。synNotch系统提供了一个重要的概念：引入人工基因环路重编程T细胞的功能来增强CAR-T细胞治疗疗效和安全性。但是该系统在临床应用中存在T细胞表达外源基因所带来的免疫排斥问题。最近研究人员新开发的与synNotch原理类似的SNIPRs系统采用了全部人源化的基因回路，解决了免疫排斥问题，但是两个载体系统使得T细胞生产工艺更复杂，同时质粒拷贝数增加伴随着T细胞恶性转化风险。

图1：SynNotch系统

03  单载体Uni-Vect系统  

为了克服这些限制，Smole等人本着“less，but better”的工业设计原则开发出一种人源化基因环路的单载体Uni-Vect系统（图2左上角）。该系统由EF-1a启动子组成型启动CAR元件表达和NFAT结合位点诱导型启动辅助分子的表达这两部分组成。EF-1a启动子可以持续激活CAR元件，多个重复的NFAT结合位点下游连接了一个Minimal promotor，只有在T细胞TCR信号识别肿瘤细胞后激活NFAT通路才会启动下游辅助分子表达。该系统克服了双载体系统的缺点，同时减轻了由于组成型表达辅助分子带来的毒副作用。

图2：Uni-Vect系统

04  双版本Uni-Vect  

引入基因环路诱导表达辅助分子通常会发生细胞在未激活状态发生泄露性表达。研究人员发现改变Uni-Vect系统中启动子转录辅助分子的方向会影响辅助分子的泄露表达和激活后的表达水平。辅助分子位于NFAT启动子正向的载体系统泄露表达相比位于反向的载体更低，而活化后位于反向的载体辅助分子的表达更高。此处，研究人员用eGFP指示辅助分子的表达水平。因此Uni-Vect设计成两种版本，分别是“low leakage’’（辅助分子位于启动子正向）和“high capacity”（辅助分子位于启动子反向）。在临床应用中可以根据治疗目的和安全性选择不同的版本。“low leakage’’适用于控制强效的免疫调节分子表达以减少毒副作用，“high capacity”可用于增加T细胞活性和杀伤力。

05  剔除内源TCR对NFAT对辅助分子的激活  

NFAT通路的活化依赖于TCR信号的激活，因此T细胞内源表达的TCR的活化会触发不必要的NFAT调控的辅助分子表达。利用CRISPR-cas9技术敲除内源TCR后，CAR-T细胞只有在CAR元件活化后才会触发辅助分子的表达，而未敲除TCR的CAR-T细胞在TCR和CAR信号刺激下都可以活化。表明剔除内源性TCR可以避免辅助分子不必要的响应。

06  装载不同辅助分子的Uni-Vect系统  

Uni-Vect系统使用NFAT信号环路启动辅助分子表达，因此可以根据治疗需求在NFAT下游装载不同的辅助分子，以实现不同的功能。例如，促炎性细胞因子IL-12、减缓细胞因子风暴的IL-6Ra、调节T细胞功能的转录因子。研究人员对装配不同辅助分子的CAT-T细胞的疗效进行了评估。接下来介绍在Uni-Vect系统装载的三种“武器”

1. IL-12促进CAR-T细胞疗效

装载有hIL-12的CAR-T细胞只有在接受肿瘤细胞刺激之后才会通过NFAT环路表达IL-12。对Uni-Vect单载体诱导表达hIL-12、EF-1a启动子组成型表达hIL-12和传统双慢病毒载体诱导表达hIL-12和CAR元件三个系统的疗效进行评估。三者对肿瘤细胞的裂解能力相似，但Uni-Vect系统的CAR-T在肿瘤细胞刺激后表现为更高效的IL-12递送效率。组成型表达IL-12和诱导表达IL-12对肿瘤生长的抑制效果相似，但是组成型表达IL-12毒副作用更大。这表明利用细胞因子提高CAR-T细胞的肿瘤治疗疗效的同时必须控制IL-12在肿瘤局部的表达。

2. IL-6Ra抗体缓解毒副作用

在一些需要脑脊髓膜内注射CAR-T细胞的应用中往往由于血脑屏障阻碍抗炎症单抗药物导致控制神经中枢毒性变得困难。在CAR-T细胞NFAT环路下游装载上IL-6Ra blocking antibody（(iToci-CAR-T）评估其肿瘤杀伤能力和抑制系统性炎症效果发现，IL-6Ra的表达并不影响对于肿瘤细胞的裂解能力，但是可以有效缓解系统性细胞因子毒性。因此Uni-Vect系统可以应用于肿瘤抗原触发CAR-T细胞自发分泌具有生物活性的IL-Ra blocking antibody来减轻细胞因子毒性。

3. 转录因子重编程T细胞

T细胞分化、扩张、适应度和抗肿瘤反应受到一些重要的转录因子的调节。通过激活一些转录因子的功能可以重塑T细胞生物学活性，这一点已经被应用于CAR-T细胞的设计中。FOXO1被证明是调控T细胞早期分化、memory和生物活性的重要转录因子。在CAR-T中引入FOXO1作为辅助因子，可以显著促进CAR-T细胞增殖，减少抑制性marker LAG-3的表达和增加效应分子的表达。这些结果表明Uni-Vect系统通过基因回路表达转录因子可以重塑CAR-T细胞转录谱，从而增强T细胞靶向肿瘤的治疗效果。

总结

T细胞在肿瘤免疫抑制的微环境下其内在功能的紊乱是限制CAR-T细胞治疗疗效的一个非常重要的因素。CAR-T细胞高效杀伤肿瘤的同时产生的细胞毒性也限制了其应用范围。因此可以在CAR-T细胞上表达不同的辅助分子来应对以上问题。但是组成型表达辅助分子往往会导致不受控制的副作用。为解决以上问题，研究人员通过装载T细胞活化依赖的基因环路诱导表达辅助分子和组成型启动子表达CAR元件，并将两者整合为一个慢病毒载体，构成  Uni-Vect系统  。该系统分为“low leakage’’和“high capacity”两个版本，可以根据对辅助分子表达水平的不同需求选择不同的版本。根据临床治疗应用可以改装Uni-Vect系统装载的辅助分子，分别用以表达免疫效应分子、抑制CRS毒性的抗体和重编程T细胞功能的转录因子等。简而言之， Uni-Vect是一个可被广泛用于升级T细胞的平台，有望成为下一代CAR-T治疗的有效工具。    

参考文献：

1.Anže Smole et al. Cancer Cell. Expression of inducible factors reprograms CAR-T cells for enhanced function and safety. Volume 40, Issue 12, 12 December 2022, Pages 1470-1487.e7

2.Iowis Zhu et al. Cell, Modular design of synthetic receptors for programmed gene regulation in cell therapies. Volume 185, Issue 8, 14 April 2022, Pages 1431-1443.e16.

3.Korbinian N. Kropp et al. Cancer cell. Less, but better: A simplified design for T cell redirection and conditional payload delivery.

作者： Windlord

编辑人：💧Transparent

来源：医药速览 2023-01-19

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