【中西合璧】电针足三里、关元和气海穴位通过PD-1通路调节脓毒症患者的免疫功能

上海中医药大学附属曙光医院麻醉科

摘要  

实验目的：本研究旨在探讨电针治疗脓毒症患者的生化和临床效果。

实验方法：纳入2019年7月至2020年12月在广东省中医院治疗的脓毒症患者。将患者随机分为常规西药治疗组(WM组)和西药加在西药基础上电针治疗组(EA组)。治疗前、治疗后3、5天测定免疫功能及临床疗效相关指标。免疫功能指标包括T淋巴细胞亚群百分比、自然杀伤细胞(NK)和可溶性程序性死亡蛋白1 (sPD-1)水平。临床疗效指标包括全血感染相关指标;肿瘤坏死因子α(TNF-α)、c反应蛋白(CRP)、干扰素γ(INF-γ)水平;并使用急性生理和慢性健康评估II (APACHE-II)和序贯器官衰竭评估(SOFA)评分进行评估。

实验结果：WM组(N=30)和EA组(N=30)的基线数据无差异。治疗后第5天，EA组sPD-1水平低于WM组。EA组CD3+T淋巴细胞比例、CD4+T淋巴细胞比例、NK细胞比例及INF-γ水平均显著高于WM组。与WM组比较，EA组治疗5 d后白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比及计数、中性粒细胞与淋巴细胞比值、CRP、TNF-α水平均显著降低。EA组治疗后5 d APACHE-II评分显著低于WM组。

结论：电针可通过PD-1通路调节脓毒症患者的免疫功能，起到抗炎作用从而改善临床症状。

背景

脓毒症是宿主被细菌或其他病原体感染引起的一系列反应，并且发病迅速、死亡率高。脓毒症也是人类死亡的主要原因。2017年，全球有4890万例脓毒症病例，导致1100万人死亡，死亡率为22.5%。脓毒症已成为急危重症医学科的一大难题。脓毒症与免疫功能障碍密切相关，表现为抗炎和促炎反应之间的失衡。

过度的炎症反应会激活抗炎机制，产生相应的抗炎介质和细胞因子来平衡促炎反应，引起代偿性抗炎反应综合征(简称CARS)。CARS是一种淋巴细胞功能和凋亡受到抑制的免疫抑制状态。在过去的20年里，研究人员一直在争论免疫功能障碍中炎症过程是否更不利于脓毒症患者的生存。炎症反应被认为是脓毒症患者早期死亡的主要原因，而CARS与免疫抑制和器官衰竭相关，被认为是脓毒症晚期死亡(诊断后几天到几周)的主要原因。然而，最近对脓毒症患者和严重创伤患者组织样本的基因组分析表明，先天免疫和获得性免疫抑制会导致持续的炎症状态，导致持续的器官损伤和死亡。尽管研究人员认为这些研究存在缺陷，但许多人认为先天免疫系统和适应性免疫系统在脓毒症的进展中同样重要。当脓毒症持续存在时，免疫系统受到抑制，进入“免疫麻痹”状态，最终导致持续的器官衰竭、继发感染和死亡。研究发现脓毒症患者固有和获得性免疫系统发生变化，包括未成熟巨噬细胞、树突状细胞(DC)和自然杀伤细胞(NK)凋亡加速，抗原呈递细胞和巨噬细胞活性降低，CD4 +T淋巴细胞应答受损，淋巴细胞凋亡增加。同时，促凋亡蛋白在体内的表达增加，消耗T淋巴细胞。因此，免疫治疗可能是改善脓毒症患者预后的一种潜在治疗方法。

电针可双向调节人体免疫功能，增强免疫抑制患者的免疫功能。我们前期研究发现，住院重症监护病房(ICU)的脓毒症患者，电针治疗后外周血CD3+T淋巴细胞(CD3 +T)和CD4+T淋巴细胞(CD4+T)亚群明显升高，器官恢复较西医治疗更快。然而，这些结果的机制尚不清楚。程序性死亡蛋白1 (Programmed death protein 1, PD-1)是一种重要的免疫抑制分子，首次在t细胞淋巴瘤中被发现。PD-1主要在活化的T细胞中表达，有研究表明NK细胞影响PD-1/程序性死亡配体1 (PD-L1)通路。因此，我们推测电针可能通过调节PD-1通路来调节脓毒症患者的免疫系统功能。

方法与受试者

1.患者的纳入和排除标准。

本研究是一项随机对照试验，纳入2019年7月至2020年12月在中国广州广东省中医院ICU转诊的血液透析患者。

患者纳入标准:年龄18-85岁，诊断脓毒症，签署知情同意书，根据中医辨证分型判断气虚证患者。

患者排除标准:(1)怀孕或精神障碍;(2)免疫缺陷或使用免疫抑制剂或免疫增强剂;(3)恶性肿瘤史。

患者退出标准:(1)住院时间< 5天;(2)不愿参与研究或配合治疗;(3)不能耐受电针治疗的患者;(4)研究过程中出现其他严重疾病的患者。

脓毒症和脓毒症休克的诊断标准参照国际脓毒症和脓毒症休克管理指南(2016)。气虚证的诊断标准以2002年出版的《中医药新临床试验研究指导原则》为依据。气虚证的诊断应结合原发和继发症状。

2.实验伦理

本试验按照《赫尔辛基宣言》和《中华人民共和国临床良好规范》及相关规定进行，并经广州中医药大学第二附属医院医学伦理委员会批准（No.yf2019145-01）。为保护受试者隐私，数据处理采用匿名方式进行，并在临床试验开始前获得每位患者或法定代理人的书面知情同意。本研究在ClinicalTrials.gov和中国临床试验注册中心注册，注册号分别为NCT05367986和ChiCTR2200059459。

3.干预措施

将患者随机分为西药组(WM组)和电针组(EA组)，采用限制性随机分组。进行随机分组的统计学人员并不知道病人的分配情况。WM组患者接受西药常规治疗。根据国际脓毒症和脓毒症休克管理指南(2016)，常规治疗包括抗生素和其他抗感染措施、液体管理、机械通气和营养支持，但不包括使用免疫抑制剂或免疫增强剂，包括激素、丙种球蛋白和胸腺素。电针组采用西药配合电针治疗。电针足三里穴(ST36)、关元穴(CV4)、气海穴(CV6)，每日2次，连续30分钟，共5天。

根据国家标准GB12346-90，国家技术监督局1990年公布的穴位定位包括:(1)足三里(ST36)，位于髌骨韧带外侧切迹下的小腿前外侧7.5cm(4横指);(2)关元(CV4)，位于脐下7.5cm，腹部中线;(3)气海(CV6)，位于腹部中线关元(CV4)与脐之间的中点。

针刺和电针方法如下，置针前对穴位消毒。(1)足三里(ST36):患者仰卧位，直径0.35mm，长度40mm，针插入皮肤90°，深度0.25-0.50cm。由一名资深的针灸科医生进行针刺操作，包括提、刺和旋转，以获得适当的针刺感觉。一旦患者报告有烧灼、麻木、肿胀、疼痛或其他感觉(得气)，将电针装置连接到针灸针上，频率设置为交替频率波。频率设置为4/20Hz，电流调节到患者能忍受的最大强度。(观察到受刺激的局部肌肉抽搐，患者耐受。)采用G-6805电针装置(上海华谊医疗电子仪器厂，中国上海)电刺激30分钟。(2)关元(CV4)、气海(CV6):患者仰卧位，一根直径0.25mm、长40mm的针90°插入皮肤，深度0.25-0.40cm。电针治疗过程与足三里相同。

4.结局指标

主要观察指标为免疫功能障碍，包括T淋巴细胞亚群百分比、NK细胞百分比和可溶性程序性死亡蛋白-1水平(sPD-1)。T淋巴细胞亚群包括CD3+T和CD4+ T的百分比。次要观察指标为临床效果，包括全血感染相关指标、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、c反应蛋白(CRP)、干扰素γ (INF-γ)、急性生理和慢性健康评估II(APACHE-II)和序贯器官衰竭评估(SOFA)评分。全血分析的相关指标包括白细胞(WBC)计数、中性粒细胞百分比及计数、淋巴细胞百分比及计数、中性粒细胞/淋巴细胞比值(N/L比)。记录治疗前及治疗开始后3、5天的预后指标。

5.随机化和盲法

采用分组随机化设计，将编码按等比例分配给实验组和对照组。由计算机生成的随机数表保存在一个密封的信封里。由于这项研究是对治疗方式的比较评估，所以盲法是不可行的。特别指派的研究人员记录研究内容并填写病例观察表。由不同的人员完成数据录入和验证，确保数据的准确性。数据收集人员和统计人员对参与者治疗的分配和进行评估的治疗团队不知情。

6.样本量计算

根据公式N =2× ((μα + μβ)2σ2)/δ2),δ = |μ1 − μ2|,估计所需样本量，采用PASS 11.0，α =0:05，β =0:1，双侧检验。由于sPD-1与脓毒症的临床干预很少，所以分析的依据是既往关于治疗对外周血sPD-1影响的研究。在一项研究中，治疗组的sPD-1水平404.27±41.26 pg/mL —517.91±52.55 pg/mL。因此，检测sPD-1的显著差异需要样本量> 20例。但是，由于本研究是关于中医免疫功能对脓毒症患者免疫功能影响的研究，我们还参考了既往电针改善脓毒症患者免疫功能的研究。在本研究中，电针与对照组对CD3+T百分比的影响分别为58.4±4.2%和54.4±3.5%。因此，我们计算出每个治疗组至少有30例患者，才能检测免疫功能参数的显著差异。本研究患者的退出率约为10%。在这些数据的基础上，最终生成了包含70名患者的随机数字表。

7.统计分析

所有统计分析均采用SPSS 22.0软件进行。数据表示为平均值±SD(正态分布)或中位数(四分位数范围(IQR);p25, p75)(异常分布)。采用Levene检验检验方差齐性。对均匀方差正态分布的资料进行独立样本t检验。非正态分布或方差不等的数据采用非参数秩和检验进行比较，组间比较采用Mann-Whitney非参数检验。分类变量以计数、百分比或比率表示，并采用卡方检验进行比较。

实验结果

1基线特征

共筛选患者78例，其中高龄1例，免疫缺陷或免疫抑制剂6例，不愿接受电针治疗7例。共入组64例患者，4例退出，2例失访，2例出现心肌梗死等其他疾病(图1)。研究结束，EA组30例，WM组30例。共有47名男性和13名女性，中位年龄为71.5岁(IQR;63.8, 78.8)。EA组男性25例，女性5例，中位年龄69.5岁(IQR;62.8, 77.0)。WM组男性22例，女性8例，中位年龄74.5岁(IQR;65.5, 79.3)。两组在性别分布、年龄、疾病特征方面无显著性差异(表1)。

2.免疫功能

治疗前两组患者CD3 +T、CD4+T、NK细胞比例及sPD1水平比较，差异均无统计学意义(均为，P >0.5)。治疗开始后5 d, EA组sPD-1水平显著低于WM组(表2)，治疗后5 d, EA组CD3+T、CD4 +T、NK细胞比例显著高于WM组(均P <0.05)(表2)。

3.临床疗效

治疗前，两组白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞计数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、N/L比值比较，差异均无统计学意义(P >0.5)。开始治疗后5天，与WM组比较，EA组白细胞计数、中性粒细胞百分比、N/L比值显著降低(P <0.05;表3)。EA组淋巴细胞百分比显著高于WM组(P <0.05;治疗前，两组CRP、TNF-α、INF-γ水平比较相似(P >0.5)(表4)。治疗开始5 d后，EA组CRP、TNF-α水平较WM组显著降低，INF-γ水平较WM组显著升高(P <0.05;治疗前，两组APACHE-II、SOFA评分比较，差异均无统计学意义(P >0.5)。治疗3 d后，EA组SOFA评分下降(P <0.05)。治疗5 d后，EA组SOFA、APACHE-II评分较治疗前显著降低(P <0.01),EA组APACHE-II评分显著低于WM组(P <0.05)(表5)。 

中西合璧述评    

脓毒症的诊断和治疗指南在不断更新，许多新疗法的确切疗效是不确定的，特别是抗炎疗法。脓毒症患者经常出现免疫功能障碍，这使得免疫治疗成为脓毒症治疗的一个活跃的研究领域。脓毒症包括先天性和后天免疫系统的改变。足三里(ST36)、关元(CV4)、气海(CV6)是电针治疗免疫功能的重要穴位。针刺这些穴位可显著提高患者的先天免疫和获得性免疫功能。CD3+T和CD4+T是获得性免疫细胞，脓毒症常伴有CD4+T数量显著减少，提示脓毒症的免疫抑制机制与CD4+T的下降密切相关。脓毒症患者CD4+T细胞数量的大幅下降也与脓毒症严重程度的增加有关。既往大鼠脓毒症模型研究提示，电针足三里(ST36)可通过提高CD3+T和CD4+T水平，显著降低炎症反应，调节免疫功能障碍。本研究结果还显示，开始治疗5 d后，EA组CD3+T、CD4+T水平明显改善。电针组CD3+T、CD4+T水平及淋巴细胞百分率明显高于WM组。提示电针可提高脓毒症患者的淋巴细胞水平，调节T细胞亚群。  

淋巴细胞百分比是免疫功能的常用指标，淋巴细胞凋亡是脓毒症“免疫麻痹”的重要步骤。自2001年Zahorec首次提出采用N/L比值评价脓毒症患者以来，N/L比值已成为评价脓毒症患者炎症免疫状态的重要指标。研究发现，电针治疗后脓毒症患者淋巴细胞百分率升高，N/L比值明显降低。近年来，许多研究发现N/L比值与APACHEII和SOFA评分相似，是评估脓毒症严重程度的独立危险因素。本研究还发现N/L比值与APACHE-II评分和SOFA评分呈正相关，EA组的N/L比值和APACHE-II评分低于WM组。因此，电针可以改善脓毒症患者的临床症状，调节免疫反应与炎症之间的平衡。两组间SOFA评分差异无统计学意义，可能与SOFA评分反映器官功能衰竭有关，其对临床预后的敏感性低于APACHE-II评分。本研究有几个局限性。首先，由于伦理问题，电针非经络和非腧穴没有对照组。其次，检测PD-1浓度，但不检测淋巴细胞或T细胞上PD-1受体的表达。这些局限性可能在未来的研究中得到解决。

电针足三里(ST36)、关元(CV4)、气海(CV6)能显著降低脓毒症患者的sPD-1水平，增加CD3+ T、CD4+T、NK细胞比例和INF-γ水平。随着T淋巴细胞和NK细胞活化和功能的改善，APACHE-II评分降低，炎症指标降低，临床症状改善。总的来说，这些结局指标表明电针足三里(ST36)、关元(CV4)、气海(CV6)可显著改善脓毒症患者的免疫功能，其机制可能与PD-1通路调控有关。此外，与sPD-1相比，mPD-1必须采用流式细胞术检测;因此，sPD-1的检测更简单，检测成本更低。这些结果提示sPD-1可作为脓毒症严重程度的指标。 

译稿：邹颖华 林超

中西合璧述评：宋建钢

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