【衡道丨笔记】NGS分子检测及案例分析

内容摘要

病理科为什么要做NGS？

恶性肿瘤是我国居民死亡主要原因之一；

每年FDA/NMPA获批实体瘤靶向药物；

卫健委强调：抗肿瘤靶向药物使用前，需进行靶点基因检测；

多基因、多种突变类型的联合检测成为分子检测的热点；

肿瘤精准治疗对基因检测通量的需求日趋增加；

单基因检测临床上存在一定缺陷；

病理科常用技术平台均不能满足大量基因联检的需求，NGS技术可以满足多基因同时检测，使更多患者最大程度从治疗中获益；

NGS技术简介

什么是NGS？

高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（NextGenerationSequencing，NGS），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

NGS实验流程

1、样本前处理及病例评估

2、核酸提取：柱提法、磁珠法。

3、核酸质控：对DNA的质量控制需要从DNA纯度、浓度以及片段化程度进行充分评估。

4、文库制备：

建库实验流程：反转录→杂交→延伸+连接→酶切→PCR。

5、文库质控：质控文库浓度、文库片段长度。

6、上机测序

（1）上机操作流程：实验前准备→文库混合、稀释和变性→上样并进行测序→测序后清洗。

（2）上机检测：文库制备，簇生成，测序，数据分析。

（3）从测序仪界面获得质量信息。

7、NGS数据分析

下载的下机分析数据会以RUN号、分析类型、分析版本号命名压缩包，解压后即可看到单次分析样本的单独结果与一份单次分析所有样本的表格文件。

8、质控标准

分子检测病例分享

病例一：

女，76岁，淋巴结活检组织，转移性低分化肺腺癌。

ARMS检测结果：5号管FAM信号（19DEL），Ct值为27.13，阳性。

NGS检测结果：

一代测序验证结果：c.2239T>G(p.L747V)。

治疗：拟行阿法替尼治疗（L861R）。

病例二：

女，59岁，（右上肺病变）浸润性肺腺癌，Ⅱ级，腺泡型及贴壁性。

ARMS检测结果：6号管HEX信号(G719X)，Ct值为29.70，阳性？阴性？

EGFR单检结果：EGFR单检7号样本孔(G719X)曲线升起，Ct值为21.46，阳性！

一代测序验证结果：G719S点突变。

病例三：

女，66岁，活检组织，（右肺上叶尖段）腺癌。

ARMS检测结果：5号管FAM信号(19DEL)，Ct值为30.1，阳性？阴性？

EGFR单检结果：EGFR单检样本孔无曲线升起，阴性？

NGS检测结果：

病例四：

女，73岁，（右半结肠）隆起型腺癌，分化Ⅱ级，癌组织浸润肠壁黏膜下层。

ARMS检测结果：1、2、3号管FAM信号(KRAS Exon2)均有曲线升起，污染？

NGS检测结果：

病例五：

男，62岁，（肠衣包裹细胞块）转移性肺腺癌。

ARMS检测结果：9号管FAM信号(KRAS Exon2)，Ct值为23.81，阳性。

KRAS单检结果：3、6号管FAM信号(G12V、G12C)均有曲线升起，Ct值为16.83和16.23，双突变?

KRAS一代测序结果：c.34,35GG>TT。

NGS检测结果：

最终确定治疗方案：化疗+免疫治疗。

病例六：

男，54岁，（结肠）溃疡性腺癌，分化Ⅲ级，癌组织侵破肠壁浆膜层。

ARMS检测结果：两个蜡块2号孔(KRAS Exon2)均有FAM信号曲线升起，Ct值为19.1和19.2。

NGS检测结果：

结果幸运的检测到了G12C。

病例七：

男，40岁，低分化腺癌。免疫组化：ALK[D5F3，Ventana]（+++）。

ARMS检测结果：ALK基因存在融合，用药两年，近期胸部CT显示右肺肿块较前增大，两肺转移较前增多。

目前治疗方案：白蛋白紫杉醇+贝伐珠单抗，同时予布加替尼靶向治疗。

NGS检测结果：

大Panel NGS检测结果：依然没有检测到病人想要的点突变。

病例八：

男，58岁，（肝部分）腺癌，分化Ⅱ-Ⅲ级，伴坏死，结合病史及免疫组化结果，符合肠腺癌肝转移。

ARMS检测结果：样本孔FAM信号无曲线升起，阴性，但出现了两份结果不同的报告。

NGS检测结果：

最后发现报告不同原因：是第一份NGS报告输入错误。

小结

多基因同步检测，检测流程优化，缩短报告等待时间；

多平台检测，相互验证；

严格审核报告，防止错误发生；

临床与病理等多学科精诚合作，才能使患者从精准诊疗中真正获益。

设计：鹏飞

编辑：小约翰