【论肿道麻】丙酸盐代谢失调促进肿瘤进展和侵袭性

从原发性肿瘤到转移性肿瘤，肿瘤细胞如何获取侵袭能力？学者们相信，找到这个问题的答案，可能为阻止肿瘤细胞扩散带来新的方法。2022年3月，威尔康奈尔医学院的Ana P. Gomes等学者在《Nature Metabolism》杂志上发表了一篇题为《Altered propionate metabolism contributes to tumor progression and aggressiveness》的研究进展，关注了肿瘤细胞代谢变化。通过小鼠模型发现，肿瘤细胞消化某些脂肪酸和蛋白质组分时的一种代谢途径--丙酸盐代谢发生失调，会增加肿瘤细胞的转移潜力。现介绍如下：

摘要    

代谢途径改变是肿瘤细胞侵袭性增强的关键特征之一。研究发现丙酸盐代谢的失调可增加乳腺癌和肺癌转移潜能。这是通过甲基丙二酰辅酶A差向异构酶（MCEE）的下调发生的，该下调由ERK2驱动的SP1/EGR1转录开关介导，由其启动子水平的转移信号驱动。MCEE的丢失导致丙酸盐外流减少以及甲基丙二酸（MMA）在细胞和肿瘤内积累。MMA是丙酸盐代谢副产物，能促进肿瘤细胞侵袭性。作者提出了以探究丙酸盐代谢失调作为肿瘤的重要促进因素和转移性肿瘤治疗的有价值潜在靶点。  

肿瘤是全球第二大死因，其中转移性肿瘤占主要比例。目前，以细胞代谢的重编程来研究肿瘤的发展及转移是一个成熟的研究领域。细胞代谢远非简单地作为细胞中营养物质分解和积累的过程而存在，而是被公认的细胞特征和功能的基本决定因素。某些肿瘤代谢物以自分泌、旁分泌和内分泌方式起作用以驱动肿瘤的进展和转移。虽然年龄、饮食和生活方式对新陈代谢以及肿瘤进展的影响已得到充分证实，但在肿瘤微环境水平上发生的代谢改变的研究将为靶向治疗提供新途径。最近，有研究证明与年龄相关的代谢物甲基丙二酸（MMA）的增加可以导致老年患者的肿瘤预后不良和肿瘤相关死亡率增加，强调了代谢改变在肿瘤进展中的重要地位。

MMA的产生对于TNBC的转移有重要意义    

肿瘤，尤其是高度侵袭性肿瘤，因其具备改变正常生理过程以实现其进展的能力而臭名昭著。本实验中，作者通过对丙酸盐代谢物进行通路富集分析，在4T1原位小鼠模型中确定了与相应的原发性肿瘤相比，三阴性乳腺癌（TNBC）发生肺转移时代谢物水平发生了显著改变。虽然该实验验证了TNBC转移的潜在代谢物和代谢途径，但它可能无法解释促进转移的代谢改变的全部过程。通过这项分析，作者确定了已知的在癌症进展中受影响的过程，例如丝氨酸代谢和氨循环。另外，作者还发现了转移性肿瘤的丙酸盐代谢途径，其中甲基丙二酸（MMA）是该途径的一种副产物，这是一种全身增加的衰老诱导代谢物，其有助于增加肿瘤侵袭性。基于这些结果，作者假设TNBC细胞可能影响丙酸盐代谢途径以积累MMA，从而使代谢方式更有利于增强肿瘤转移。为了测试肿瘤内MMA水平升高是否与转移相关，作者使用LC-MS/MS检测了原发肿瘤中针对4T1乳腺肿瘤小鼠模型的转移性肿瘤的MMA浓度。研究结果证实，转移瘤中的MMA浓度明显高于原发性肿瘤。此外，从单个乳腺肿瘤分离的克隆亚群中发现，与局部侵袭性4TO7克隆相比，广泛转移的4T1克隆（能够形成转移瘤）的MMA水平显著增高，且后者具有突破原发肿瘤的能力，前者仍处于转移性休眠状态，并且无法继发性生态位定植。针对这些观察结果作者提出了MMA浓度增加是否可以推广到人类癌症的问题，并测量了一组人类乳腺细胞系中的MMA水平，包括一个乳腺上皮细胞系，三个受体阳性乳腺癌细胞系和四个TNBC转移性细胞系。作者观察到，与受体阳性乳腺癌或乳腺上皮细胞系相比，转移性TNBC细胞系MMA水平显著增加（图1）。这些观察结果表明，MMA的产生和积累对于TNBC的成功转移可能至关重要。

图1 甲基丙二酸在乳腺癌转移中上调

MCEE是转移诱导剂丙酸盐代谢失调的靶点    

为了确定细胞内MMA水平的增加是否为转移过程中的早期和潜在驱动事件，作者分别用转移诱导剂TGFβ和TNFα处理MCF10A和HCC1806细胞（受体阴性乳腺上皮和原代TNBC细胞系）。TGFβ和TNFα，长期以来一直被认为有助于肿瘤获得转移性，特别是通过它们在癌细胞中诱导EMT的能力，以及它们促进肿瘤微环境的能力。三天的TGFβ/TNFα处理足以增加这些细胞中的MMA水平，从而促进EMT和获得侵袭性状。为了确定MMA是由丙酰辅酶A还是由TCA循环的中间体产生，研究者使用组合13C 标记的缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和蛋氨酸 （AA），以监测通过丙酸盐代谢途径通量；或13C标记的葡萄糖和谷氨酰胺（GG），用于监测通过TCA循环，测量它们对MMA产生的贡献。虽然作者不能排除奇链脂肪酸（OCFA）分解代谢的实质性贡献，但数据表明，细胞内MMA增加的主要部分来自AA通过丙酸盐代谢途径分解代谢。为了确定MMA是如何增加的，作者测量了参与丙酸盐代谢的酶的表达。在MCF-10A和HCC1806细胞中，TGFβ/TNFα促进甲基丙二酰辅酶A差向异构酶（MCEE）表达的丧失，这与上皮的丧失和间充质标志物的增加有关。MCEE将甲基丙二酰辅酶A的D-异构体转化为L-异构体，L-异构体可被甲基丙二酰辅酶A变位酶（MUT）下游作用，产生琥珀酰辅酶A，随后进入TCA循环。MCEE丢失导致D-甲基丙二酰辅酶A的积累，从而增加MMA，如TGFβ/TNFα介导的MCEE抑制（图2）。此外，作者发现MCEE丢失与4T1克隆的转移能力相关，与局部侵袭性克隆相比，广泛转移的表达降低。作者还观察到在转移性细胞系中MCEE的蛋白表达降低。当比较受体阴性的原发癌细胞与从转移性TNBC获得的细胞时，作者观察到丙酰辅酶A羧化酶（PCC）表达增加，尽管在研究的时间范围内，这不是由TGFβ/TNFα诱导的。这些数据表明，甲基丙二酰辅酶A的D-异构体转化为L-异构体是TGFβ/TNFα破坏丙酸盐代谢的常见靶点，也是转移信号传导期间MMA产生增加的可能来源。另外，这一观察结果并非特定于TNBC，因为用TGFβ/TNFα治疗肺腺癌细胞（A549）也可促进这一类型癌症中转移特性的获得，也促进MMA积累的增加，这与抑制MCEE表达有关。根据MCEE的表达对TNBC转移的重要性和公开数据库的分析表明，MCEE在淋巴结阳性TNBC中低表达，患者生存率会显著降低，预后不良。综合这些数据表明，MCEE是转移诱导剂丙酸盐代谢失调的靶点，也是TNBC中重要的代谢调节节点。

图2 细胞内MMA的产生促进EMT和侵袭性

MCEE表达减少源于转录重编码驱动的基因表达改变  

接下来，作者验证MCEE表达如何受到转移信号的调节。大部分转移过程源于转录重编码驱动的基因表达改变，因此作者要验证MCEE表达减少是否是转录改变的结果。该研究在MCEE mRNA水平用TGFβ/TNFα诱导MCEE启动子活性的显著丧失证实，TGFβ/TNFα对MCF10A和A549细胞中MCEE蛋白水平的抑制是源于转录过程基因表达的改变。在分析MCEE启动子区域时，作者发现重叠的EGR1/SP1结合位点都是ERK的下游效应子。作者之前发表对研究结果已经证明，重叠的EGR1/SP1结合位点可以作为ERK2信号传导下游的开关。在ERK2信号传导时，磷酸化的SP1（该启动子的正调节因子）去磷酸化，而该启动子的负调节因子EGR1被显著诱导，取代SP1并促进转录抑制。为了确定是否存在类似的机制，作者使用了ERK2 D319N诱导的MCF10A细胞转移信号传导模型。与TGFβ/TNFα诱导的乳腺癌和肺癌细胞一样，作者发现与对照细胞相比，ERK2 D319N表达抑制了MCEE的表达，同时显著增加了MMA水平。另外，在该ERK2 D319N过表达系统中，MCEE启动子活性也受到抑制，支持ERK2驱动的EGR1 / SP1结合位点的转录调控。此外，在MCF10A和HCC1806细胞中敲低SP1模拟ERK2介导的MCEE抑制，SP1的磷酸化模拟突变体能够在ERK2诱导的MCF10A细胞中挽救MCEE表达，而野生型SP1和不可磷酸化形式的SP1保持抑制。根据该模型，抑制ERK就抑制了TGFβ/TNFα诱导EGR1和SP1去磷酸化的能力，并同时阻断了TGFβ/TNFα介导的MCEE表达抑制。总之，数据证明依赖于ERK的转移信号通过创造一个环境来促进MMA的产生，其中磷酸化的SP1（MCEE表达的正调节因子）去磷酸化并在MCEE的启动子区域中被EGR1取代，拮抗MCEE表达（图3）。 

图3 转移信号通过调节MCEE导致MMA产生

丙酸盐代谢和MMA积累可以促进小鼠的癌症进展    

为了强调丙酸盐代谢失调与肿瘤转移进展之间的联系，作者采用了遗传学方法进行验证。MCEE敲低，模仿其被转移诱导剂抑制并导致MMA水平升高，足以调节MCF-10A、HCC1806和A549细胞中与癌症进展相关的侵袭性标志物的表达，包括上皮缺失和间充质标志物增加。然后，作者验证通过改变丙酸盐代谢途径的其他靶点来增加MMA是否可以同样增加肿瘤转移侵袭性。为此，作者在A549，MCF-10A和HCC1806细胞中敲低了MUT，这也导致MMA水平升高，并且在MCEE敲低中，亲攻击性标志物被改变。作者之前已经证明MMA足以诱导促转移基因表达谱，同样，MUT的敲低也诱导了具有转移特征的相似基因表达谱，包括SOX4，TFGB1，TGFBR1和TGFBR2的表达增加。据报道，维生素 B12 缺乏者的血清中MMA水平升高，因为 MCEE下游的MUT活性需要维生素B12。事实上，从培养基中消耗维生素B12也复制了这种效果，敲低MMAB也是如此，MMAB是编码 cob（I）alamin 腺苷转移酶的基因，可将维生素 B12 转化为 MUT 利用的生物活性形式。为了进一步确定丙酸盐代谢和MMA积累是否可以促进小鼠的癌症进展，作者在转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞中敲低了MUT。在这些细胞中MUT表达的降低增加了MMA水平，并增加了细胞在跨孔测定中的迁移和侵袭能力。随后，作者证明这些细胞在尾静脉注射后在小鼠肺部定植和生长的能力增强。

 图4 抑制 MUT 诱导亲攻击性标志物重编程

PCC可能构成转移性TNBC的有价值的治疗靶点    

丙酰辅酶A羧化酶（PCC）催化BCAA和OCFA衍生的丙酰辅酶A，因此通过丙酸盐代谢途径调节通量和产生MMA。据此，PCC的过表达导致丙酰辅酶A水平升高，从而通过丙酸盐代谢途径的通量增加，如MMA和琥珀酸盐以及其他TCA循环中间体，反映其对MMA水平的影响。PCC在HCC1806，MCF-10A和A549细胞中的过表达促进了促转移标志物的表达。虽然PCC过表达对细胞的迁移能力没有显著影响，但MDA-MB231细胞尾静脉注射后，PCC过表达显著增加了侵袭能力和肺定植。为了进一步支持PCC对癌细胞内源性MMA产生的重要性，敲低PCCA（PCC酶复合物的功能所必需的亚基之一）消除了TGFβ/TNFα介导的MMA水平增加。另外，敲低PCCA虽然本身对非转移性癌细胞中的侵袭性标志物没有影响，但足以部分阻断这些细胞中TGFβ/TNFα诱导的侵袭性特性。然而，PCCA敲低在诱导外源性MMA的侵袭性方面没有影响，进一步支持依赖MMA进行PCC介导的对亲攻击性属性的调节（图5）。最后，已经分离出MDA-MB-231克隆细胞系MDA-MB-231-LM2，其肺定植和生长能力大大提高。此外，MDA-MB-231-LM2细胞与其亲本系有效形成转移性集落的能力较低，这些细胞中PCC的敲低显著抑制了它们的转移潜力，以MMA依赖性方式影响它们间充质标志物的表达，抑制了它们在跨孔测定中迁移和侵袭的能力。在另一种具有高转移潜力的细胞系Hs578T中，PCCA敲低也影响了它们的增殖能力，并降低了它们在小鼠肺部定植的能力。虽然不能排除这种效应可能受到与MMA水平无关的TCA周期中间体变化的影响的可能性，但本项研究数据揭示了PCC在癌细胞内源性产生MMA中的重要调节作用，并表明PCC可能构成转移性TNBC的有价值的治疗靶点。

图5  PCC调节MMA水平并确定亲攻击性

总结  

作者曾在之前的研究中证实了代谢物MMA和衰老以及肿瘤预后之间的重要联系。本研究中，研究者证明高度侵袭性肿瘤（如TNBCs）可以通过肿瘤细胞本身改变丙酸盐代谢以增加MMA水平，从而进行促转移的重编程。研究者提出肿瘤细胞以内源性代谢副产物的积累为中心，通过MCEE的转录抑制，阻碍丙酸盐代谢的通量，导致MMA的积累，从而获得疾病进展所必需的侵袭特性和能力。虽然作者揭示了丙酸盐代谢失调导致肿瘤内MMA积累，以及MMA累积对肿瘤产生和进展以及衰老具有双重作用，强调了MMA在癌症中的重要性，但许多问题仍有待阐明，比如肿瘤细胞产生的MMA是否主要以自分泌方式起作用，或者它是否可以分泌作用于邻近的肿瘤细胞和其他细胞类型？MMA如何调节转录程序从而影响肿瘤细胞侵袭力？某种程度上，代谢物对肿瘤转化机制研究似乎以前被低估了。作者的研究结果为进一步的研究提供了基础和方向，可以想象该领域的深入探索将极大程度拓宽我们对肿瘤微环境，衰老和癌症中代谢重编程的认知。  

编译：王晓璇；曹书梅    

审校：张军；缪长虹  

参考文献：Gomes AP, Ilter D, Low V, et al. Altered propionate metabolism contributes to tumour progression and aggressiveness.Nat Metab. 2022;4(4):435-443. doi:10.1038/s42255-022-00553-5  

声明：古麻今醉公众号为舒医汇旗下，古麻今醉公众号所发表内容之知识产权为舒医汇及主办方、原作者等相关权利人所有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制、裁切、录制等。经许可授权使用，亦须注明来源。欢迎转发、分享。