快报 | 基于微球技术的xMAP TIER检测用于一线抗结核药物耐药性预测的评价研究

作者：欧喜超，张治国，赵冰，宋泽萱，王胜芬，何文从，裴少君，刘东鑫，邢睿达，夏辉，赵雁林

第一作者及单位：欧喜超，中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心；张治国，北京市昌平区结防所

通信作者及单位：赵雁林，中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心

Evaluation Study of xMAP TIER Assay on a Microsphere-Based Platform for Detecting First-Line Anti-Tuberculosis Drug Resistance.

Ou X, Zhang Z, Zhao B, Song Z, Wang S, He W, Pei S, Liu D, Xing R, Xia H, Zhao Y.

Int J Environ Res Public Health, 2022, 19(24):17068.

doi: 10.3390/ijerph192417068.

PMID: 36554951. 

研究背景

耐药结核病对全球公共卫生的威胁日益严重，世界卫生组织终止结核病流行策略要求对所有确诊肺结核患者进行抗结核药物敏感性试验（简称“药敏试验”），但目前全球在耐药结核病筛查领域仍存在很大差距，2020年，约30%的细菌学确诊肺结核患者未能开展抗结核药物耐药性检测。传统基于培养的表型药敏试验费时费力，不能为患者提供及时准确的检测结果。抗结核药物耐药主要是药物作用靶标基因或参与药物活化的基因发生突变所致，如利福平（RIF）耐药主要是由于rpoB基因发生突变，异烟肼（INH）耐药与inhA和katG基因突变相关，乙胺丁醇（EMB）耐药涉及embB基因的突变，基因型药敏试验可通过识别上述一线抗结核药物耐药相关基因是否突变来预测耐药性，弥补了表型药敏试验检测周期长的不足，目前世界卫生组织推荐的一线抗结核药物基因型药敏试验检测技术主要包括Abbott RealTime MTB RIF/INH、BD MAX MDR-TB、Cobas MTB-RIF/INH、FluoroType MTBDR和Xpert MTB/RIF。

基于微球的Luminex高通量多重检测（xMAP）平台最多可以在单个反应管中分析多达500个不同的检测靶标。通过针对不同待测物靶标基因设计寡核苷酸探针，以共价偶联的方式结合到特定的编码微球上，每个编码微球对应相应的检测指标，能够在一次反应中同时捕获多种分析产物。xMAP集成多重PCR扩增和微球杂交技术，为高通量的耐药结核病诊断提供了一个崭新的平台。本研究通过对表型肉汤微孔板药敏试验和全基因组测序结果的比较，评价基于xMAP平台的TIER检测用于3种一线抗结核药物耐药性预测的检测效能。

材料和方法

1. 结核分枝杆菌菌株传代培养：从中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室选取353株结核分枝杆菌临床分离菌株，在罗氏固体培养基上传代培养3～4周。

2. 表型肉汤微孔板法药敏试验：使用Sensititre® MYCOTB plate进行微孔板法药敏试验，同时对13种抗结核药物进行测试，包括INH、RIF和EMB。参考CLSI M62，INH、RIF和EMB的临床折点浓度分别为0.12 μg/ml、1 μg/ml和2 μg/ml。EMB最低抑菌浓度（MIC）为4 μg/ml时，定义为不确定结果。

3. xMAP检测：从罗氏固体培养基表面挑取1环分离培养物，悬浮在500 μl TE缓冲液中，100 °C煮沸15 min后，12 000 × g离心5 min，将含有核酸模板的200 μl上清液转移到新的离心管中进行xMAP TIER检测[海仕兰（上海）生物科技有限公司]。16S和λ噬菌体用于整个检测过程的质量控制，包括核酸提取、多重PCR扩增和杂交。xMAP TIER检测的主要步骤如图1所示，可检测10个耐药相关基因突变位点的17个特定突变位点类型（表1）。

4.全基因组测序（WGS）：利用Illumina HiSeq 2000平台对CTAB法提取的结核分枝杆菌基因组DNA进行WGS。采用世界卫生组织推荐的Clockwork分析流程对所有原始WGS数据进行分析，检测到Group 1（与耐药相关）和Group 2（暂时与耐药相关）耐药相关突变的菌株被定义为基因型耐药，未检测到相关基因突变的菌株被定义为基因型敏感。

5.统计学处理：将表型药敏试验结果与WGS检测结果比对，评价xMAP TIER检测用于RIF、INH和EMB耐药性预测的检测效能（敏感度和特异度）。

研究结果

采用xMAP TIER、表型微孔板法和WGS对353株结核分枝杆菌临床分离株进行RIF、INH和EMB药敏试验。参考微孔板药敏试验结果，在353株临床分离株中，发现耐多药61株、单耐INH 77株、单耐RIF17株、INH和RIF均敏感198株（图2）。14株结核分枝杆菌对EMB的最低抑菌浓度（MIC）为4 μg/ml，检测结果不确定；311株对EMB敏感，28株对EMB耐药。在353株结核分枝杆菌分离株中，鉴定出3个主要谱系，分别为谱系2占66.2% (234/353)、谱系3占5.6% (20/353)、谱系4占28.2% (99/353)，见图2。rpoB、katG、inhA、ahpC和embB基因突变分离株分别占22.4% (79/353)、30.0% (106/353)、8.5% (30/353)、1.1% (4/353)和10.5% (37/353)，见图2。

与表型药敏试验结果相比，xMAP TIER检测RIF耐药性的敏感度和特异度分别为94.9% (95%CI：90.0% ~ 99.8%)和98.9% (95%CI：97.7% ~ 100.0%)，检测INH耐药性的敏感度和特异度分别为89.1% (95%CI：83.9%~ 94.3%)和100.0% (95%CI：100.0% ~ 100.0%)，检测EMB耐药性的敏感度和特异度分别为82.1% (95%CI：60.8% ~ 96.3%)和99.7% (95%CI：99.0% ~ 100.0%) (表2)。

在78株RIF表型耐药分离株中，4株经xMAP TIER检测鉴定为RIF敏感。WGS结果显示，4株均存在rpoB基因突变 (Q432E、H445L、H445R)。3株RIF表型药敏试验敏感菌株，经xMAP TIER检测为RIF耐药，WGS结果显示，2株存在rpoB基因型突变 (L430P) (表2)，另外1株通过xMAP TIER检测到S450L突变，但WGS未发现突变。

xMAP TIER和表型药敏试验对338株结核分枝杆菌的INH药敏检测结果一致。15株xMAP TIER检测敏感但表型药敏试验结果为耐药菌株；WGS结果显示，5株未发生突变，可能是由于其他未知耐药机制导致的表型耐药，其余10株含有未被列入xMAP TIER检测的基因型突变 (表2)，在3株分离株中检测到katG_S315N突变（Group 1），1株检测到katG_2050_ins_2_T_TGC突变（Group 2），其余6株检测到Group1或Group2中未列出的突变类型 (katG_Asn138Asp; katG_Val1Ala; ahpC_-52C > T, katG_Asp735Ala; ahpc_c - 81 t; ahpC_-48G>A, katG_ Asp94Gly)。

在339株具有EMB表型药敏试验结果的分离株中，5株EMB表型耐药但xMAP TIER检测敏感，4株存在基因型突变 (embA_C-12T, embB_Y319C;  embB_Y319S; embB_G406A; embB_G406S) ，突变位点类型超出xMAP TIER检测范围，第5株未发现突变，可能是由于其他未知耐药机制导致的耐药。1株xMAP TIER检测为EMB耐药，但表型药敏试验为EMB敏感，WGS法检测到embB突变 (embB_M306V)。

与WGS结果比较，xMAP TIER检测RIF耐药性的敏感度和特异度分别为95.0% (95%CI：90.2% ~ 99.8%)和99.6% (95%CI：98.9% ~ 100.0%)；检测INH耐药性的敏感度和特异度分别为96.9% (95% CI：93.8%-99.9%)和100.0% (95%CI：100.0%~100.0%)；检测EMB耐药性的敏感度和特异度分别为86.1% (95%CI：74.8%~97.4%)和100.0% (95%CI：100.0%~100.0%) (表3)。5株WGS发现EMB耐药，而xMAP TIER检测为敏感；4株存在基因型突变 (embA_C-12T, embB_Y319C; embB_Y319S; embB_G406A;embB_G406S)，超出了xMAP TIER的检测范围。第5株含有embB_G406D，未被纳入xMAP TIER检测，但由于EMB的表型药敏试验结果不确定，也被排除在进一步分析之外。

研究结论

xMAP TIER对于一线抗结核药物耐药性的检测具有非常好的检测效能，在开放式的xMAP检测平台基础上，通过加入更多优化设计的引物和探针，将可以更准确地诊断耐药结核病，具有非常好的临床应用前景。

注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。

供稿：欧喜超

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布时间：2023-01-18

打赏