Science | 揭示囊性纤维化治疗药物的作用机制

囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）是一种常见的致命的遗传性疾病1，它由编码cystic fibrosis transmembrane conductance regulator （CFTR）的基因突变引起2,3。CFTR广泛的表达在上皮细胞的细胞表面，调节体内多个组织器官的水盐平衡。CFTR的缺失或异常会引起营养不良，肝脏疾病，反复的细菌感染，慢性炎症及呼吸衰竭4。

CFTR蛋白属于ATP-binding cassette （ABC）超家族。与其它利用ATP水解产生的化学能来逆浓度梯度的转运底物的ABC转运蛋白不同，CFTR是顺电化学梯度转运阴离子的ATP门控离子通道。结构上，CFTR包含了一个N端的lasso motif, 两个形成阴离子转运通路的跨膜结构域（TMDs），两个可以结合和水解ATP的胞内核苷酸结合结构域（nucleotide-binding domains, NBDs）以及一个独特的调控结构域 （R domain）--R domain的磷酸化是通道开放的必要条件。CFTR第508位的苯丙氨酸缺失（Δ508）是CF病人最常携带的基因突变, 该突变会引起严重的蛋白运输缺陷从而导致CFTR在胞内滞留和提前降解。即使能够到达细胞膜表面, Δ508 CFTR的功能也严重受损5,6。此前的假说认为，F508的缺失可能会导致NBDs的组装异常和易降解，但是由于突变体自身的不稳定性，Δ508 CFTR蛋白的全长结构一直没有得到解析。

近年来CFTR调节剂的开发使得CF的治疗从缓解症状提升到了疾病的矫正。这些调节剂分两类：可以增强细胞膜上CFTR功能的增效剂（potentiators）和增加细胞膜表面CFTR丰度的矫正剂（correctors）。现有的用于治疗CF的药物有四种，包括增效剂ivacaftor (VX-770), I型矫正剂lumacaftor (VX-809) 和tezacaftor (VX-661), 以及 III型矫正剂 elexacaftor (VX-445)。目前最先进的治疗手段是Trikafta三联疗法，即ivacaftor，tezacaftor还有elexacaftor三种药物合并使用。虽然现在领域内对ivacaftor和I型矫正剂的作用机制已略知一二，但是elexacaftor作为最晚发现的药物其工作机制仍有待探索。

2022年10月，来自美国洛克菲勒大学的Jue Chen团队在Science上发表了题为Molecular structures reveal synergistic rescue of Δ508 CFTR by Trikafta modulators的文章。该研究解析了Δ508 CFTR分别在apo和与调节剂结合状态下的多个冷冻电镜结构。这些结构不仅为Δ508导致的CFTR功能异常提供了可能的解释，也揭示了多个调节剂协同纠正CFTR功能的分子机制。

首先，研究者们解析了Δ508 CFTR在apo状态下的冷冻电镜结构。为了稳定蛋白结构，研究者们引入了能够稳定ATP结合和NBD二聚化的E1371Q突变。接下来研究者们纯化了在内质网上滞留的Δ508/E1371Q CFTR，并解析了未磷酸化/无ATP结合和磷酸化/有ATP结合两种状态的结构 （图1）。在分辨率为6Å、未磷酸化/无ATP结合的结构中，NBD1和NBD2处于分开的构象，与WT CFTR相似。NBD1的密度难以分辨其二级结构，说明Δ508 NBD1虽然折叠正常但柔性很大。磷酸化/有ATP结合的Δ508 CFTR稳定性更差，分辨率仅9Å。虽然总体上呈现出NBD二聚化的构象，但是NBD1的密度几乎不可见。通过上述结构可知，F508的缺失使得NBD1柔性过大，难以支持两个NBD形成稳定的二聚体。由于NBD的二聚化与CTFR的开放相互偶联，Δ508导致的NBD组装异常可能是导致通道功能受损的原因。

图1. Δ508/E1371Q CFTR的两种构象

接下来，为了探究矫正剂对蛋白构象的影响，研究者们在磷酸化/有ATP结合的CFTR背景上加入了4种药物并解析了他们的冷冻电镜结构 （图2A）：(i) lumacaftor，(ii) elexacaftor, (iii) 二者联合，以及 (iv) Trikafta 三联疗法（即ivacaftor, tezacaftor 和 elexacaftor联合）。为了保证药物对蛋白的影响是在翻译后而不是蛋白合成过程中产生的，所有矫正剂均在纯化过程中添加。如图2A所示，Δ508 CFTR的结构在lumacaftor添加前或添加后没有明显变化，说明lumacafter主要在早期蛋白的生物合成过程中起作用，而不是在蛋白翻译后产生影响，这与此前对I型矫正剂的作用机制的理解一致。

图2A. Δ508/E1371Q CFTR 与调节剂结合的示意图

相反，III型矫正剂elexacaftor可以稳定NBD1，使与之结合的Δ508 CFTR结构分辨率达到了3.76Å且具有有序的NBDs。Elexacaftor结合的Δ508 CFTR的TMDs与磷酸化/有ATP结合的结构类似，但是NBD 二聚体则呈现一种“cracked-open”的构象，即在degenerate site处ATP仅与NBD1结合面互作，另一侧呈现溶剂可及的状态（图2B）。

联合使用elexacafter和lumacafter的效果大于单独使用任一矫正剂，它们复原了NBD二聚化的构象图（图2C），并且ATP完整的占据了两个结合位点 (degenerate site 和 consensus site)。另外，使用Trikafta (即上两种药物的基础上添加ivacaftor) 后CFTR没有进一步变化，说明ivacafter是蛋白的增效剂而非矫正剂。因为图2C和图2D的两个结构与WT CFTR的结构很接近，研究者们将两个结构称为“矫正后（corrected）”的构象，并且将Trikafta 结合的结构用作后续分析。

图2B-D. Δ508/E1371Q CFTR 与调节剂结合的结构

比较Trikafta矫正后的Δ508与WT CFTR结构发现，二者在F508的区域结构有所不同。F508位于NBD1上与TM helix11交界的一段loop表面，F508的缺失使得loop缩短，在NBD1/TMD的交界处留下了一处空隙，而这个空隙被R1070的侧链所填充，R1070的侧链与NBD1的主链原子也产生了互作并稳定了NBD1的结构。这一结构与此前的V510D突变通过与R1070形成盐桥从而稳定Δ508 CFTR的结论相互印证，说明了结构的可靠性。

在Trikafta结合的Δ508结构中，三种小分子药物的密度均清晰可见（图3）。从胞外垂直看向细胞膜，三种复合物像一条腰带一样环绕CFTR的TMDs。与WT CFTR的结合位点一样，增效剂ivacaftor结合在Δ508由TM helices 4,5和8形成的裂隙内。类似的, tezacafter插入在TMD1内部的由TM helices1,2,3,6围成的疏水口袋中，起到连接和稳定TMD1 helices的作用。

图3.Trikafta矫正后的Δ508 CFTR结构

Elexacaftor与CFTR的结合位点此前未被报道 过，在Trikafta结合的结构中，elexacaftor在细胞膜内与CFTR结合，通过静电作用和范德华力与TM helix 11形成广泛互作，并且与TM helices 2, 10 以及lasso motif 都有接触（图4A）。为了确认elexacaftor的结合位点及矫正模式，研究者进行了R1102A突变，该突变破坏了药物分子与CFTR的氢键和盐桥连接。通过binding assay，gel-shift assay以及电生理实验，研究者们发现R1102A削弱了elexacaftor与Δ508 CFTR的结合，抑制了蛋白的成熟，并且消除了elexacaftor对电流的增强作用 （图4B-D），这些结果都提示elexacaftor的增效和矫正效果是通过同一个结合位点来发挥的。

图4. Elexacaftor的结合位点及功能研究

综上，研究者们解析了Δ508 CFTR的全长结构及其与Trikafta结合的结构。结合前人的结果研究者们推测了Trikafta三联疗法协同矫正CFTR功能的机制：I型矫正剂tezacaftor在CFTR生物合成的早期能够稳定TMD1的N端结构；III型矫正剂elexacaftor则在合成晚期促进TMDs的组装和折叠，二者共同抑制了蛋白在ER上的降解。一旦CFTR到达细胞膜表面，elexacaftor还能加强ATP-结合的NBD二聚体与通道门控的偶联，从而增加通道的导通性。此时ivacaftor的结合进一步稳定了通道的开放构象，提升了通道活性。

参考文献

1. M. Shteinberg, I. J. Haq, D. Polineni, J. C. Davies, Lancet 397, 2195–2211 (2021).

2. B. Kerem et al., Science 245, 1073–1080 (1989).

3. J. R. Riordan et al., Science 245, 1066–1073 (1989).

4. D. B. Sanders, A. K. Fink, Pediatr. Clin. North Am. 63, 567–584 (2016).

5. S. H. Cheng et al., Cell 63, 827–834 (1990).

6. W. Dalemans et al., Nature 354, 526–528 (1991)

供稿 | 赵雅娴

审稿 | 王雨蒙

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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