膜性肾病相关自身抗体谱临床应用进展

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本文刊载于《临床实验室》杂志2022年12月刊“自身免疫性疾病实验诊断”专题-「专家论坛」版块

作者：罗静  秦艳

单位：山西医科大学第二医院风湿免疫科，山西，太原030001

0 1 膜性肾病概述

膜性肾病(Membranous nephropathy, MN)是以免疫复合物和补体成分上皮下沉积及新基底膜合成导致肾小球毛细血管壁增厚为特征的肾脏免疫性疾病。免疫复合物沉积和膜攻击复合体形成引起足细胞结构病理生理紊乱导致的患者血清白蛋白水平下降，蛋白尿和全身性水肿是其主要临床特征。原发性MN是非糖尿病成人特发性肾病综合征最常见的病因，在65岁以上成人中高达58%，肾脏预后较差。循环自身抗体与足细胞表面的内源性靶抗原结合为原发性MN的主要致病机制。

目前，MN的治疗主要集中于免疫抑制、单克隆抗体及联合治疗。但免疫抑制是抗原非特异性治疗方式，可导致整个免疫细胞的广泛损耗，进而增加罹患恶性肿瘤的风险。因此，为减少免疫抑制作用，更有针对性、特异性的单克隆抗体被使用，如CD20靶向药物利妥昔单抗，耐受性良好，但仅60-70%的患者可达到临床缓解，而环磷酰胺治疗缓解可达80%。因此，阐明免疫复合物形成过程、识别相关自身抗体的靶向确切表位和确定肾小球病理生理机制一直是临床和实验室研究的重点。

0 2 自身抗体谱进展

1.抗PLA2R抗体

Beck于2009年在约70%成年初发MN患者的肾小球蛋白提取物中分离出185kD的一种跨膜糖蛋白，主要局限于肾小球足细胞，即PLA2R。大多数PLA2R抗体阳性的MN患者在肾小球毛细血管壁有强烈的颗粒状PLA2R染色，在正常肾脏或其他肾小球疾病中，该抗原仅在足细胞表面微弱可见。PLA2R是成人原发MN 中主要的足细胞抗原。主要分为两型(M型与N型)，M型PLA2R已被确认为自身抗体的主要靶抗原。

2.抗THSD7A抗体

2014年，在PLA2R之后，Tomas等通过免疫印迹在2%-5%的MN患者的肾小球提取物的纯化糖蛋白中检测到分子大小为250kD的蛋白。该蛋白经质谱鉴定为THSD7A，为1型跨膜蛋白。THSD7A表达于足突的基底面，大多数抗THSD7A抗体亚型为IgG4。2016年，Tomas等从患者血清中分离出抗THSD7A抗体并将其注射给小鼠，发现小鼠足细胞结合THSD7A抗体可导致蛋白尿的发生和典型MN的组织病理学模式。进一步的体外实验表明，抗THSD7A抗体直接诱导表达THSD7A的肾小球上皮细胞的细胞骨架重排，并激活局灶性粘附分子介导的信号转导。另小规模的队列研究表明，与PLA2R类似，THSD7A抗体水平的降低也伴随着蛋白尿的减少，这表明与疾病的发生和持续存在因果关系。

3.其他新兴抗原与抗体的发现

近年，Sethi先后鉴定出PLA2R阴性MN患者的四种新抗原，外泌蛋白酶(EXT1/EXT2)、神经表皮生长因子样1蛋白 (neural epidermal growth factor-like 1, NELL-1)、信号素3B (semaphorin-3B , SEMA3B)和原钙粘蛋白7 (protocadherin 7, PCDH7)，SEMA3B阳性大多为年龄<2岁的儿童MN患者，而老年人多表达PCDH7。抗EXTl/EXT2，NELLl与SEMA3B的自身抗体均以IgGl亚型为主，抗PCDH7 IgG1和IgG4均被检测到。在PLA2R阴性MN的队列中，EXT1/EXT2是最常见的独特蛋白，在自身免疫继发MN中亦存在。在MN患者的血清中，ELISA检测到高水平的抗甲酸精-1(Formin- like 1, FMNL1)FMNL1 IgG4。同时显示肾脏中FMNL1阳性细胞与肾小球中的CD68共定位，这可能表明抗FMNL1 IgG4可能在MN疾病的进展中发挥作用。此外，一些蛋白也被报道为MN中潜在的自身抗原。

0 3 检测方法

蛋白免疫印迹 (Western blotting, WB)由于其复杂和耗时，不适于临床实验室常规使用。第一个商业化的抗PLA2R抗体检测试剂盒是德国Euroimmun公司的间接免疫荧光 (indirect immunofluorescence, IIF)。该检测系统利用表达人PLA2R1的固化HEK 293细胞，检测血清中PLA2R1特异性抗体，IIF对PLA2R1抗体的检测具有高的敏感性和特异性，但IIF只允许半定量检测抗体水平，因此，酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)随后被研发，ELISA允许对抗体水平定量检测，目前在许多临床实验室中被常规使用。但ELISA亦有局限性，如敏感性低于WB和IIF。特别在持续蛋白尿且ELISA检测阴性的情况下，需使用IIF再次复测。

IIF和ELISA亦被用于血清中抗THSD7A抗体的检测。一项研究对ELISA、IIF、WB和活检染色检测抗THSD7A抗体的性能进行评估，表明ELISA与IIF效价显著相关。

近年来，定位激光免疫分析法 (laser bead immunoassay, ALBIA)被应用于抗 PLA2R 抗体的检测，该方法基于免疫荧光技术使用承载完整重组蛋白质的可定位激光珠进行检测，具有多指标联合检测、标本用量少等优点。在大量患者队列中分析不同检测方法的敏感性和特异性的研究将有助于更好地确定不同技术的检测特点。PLA2R和THSD7A抗原也可通过在石蜡切片上使用免疫荧光或免疫过氧化物酶法进行检测，并使用多克隆抗PLA2R或THSD7A抗体进行诊断。值得一提的是，肾活检始终是判断肾小球损伤类型的金标准。

0 4 临床应用

1. 基于血清自身抗体的诊断价值

抗PLA2R抗体是诊断MN高度特异的血清学标记物，PLA2R抗体在其他肾脏或系统疾病患者或健康个体中均未被检测到。研究表明原发性MN患者PLA2R水平增高，血清中抗PLA2R抗体水平亦显著升高。一项Meta分析显示抗PLA2R抗体诊断MN敏感度为78%，特异度为99%，阳性预测值与肾活检相当，这提示肾活检不一定是诊断MN的必要条件。

目前，抗THSD7A抗体在健康对照组或其他肾脏和系统疾病患者中尚未被检测到，对MN病变具有100%的特异性。值得注意的是，THSD7A相关MN中，大量患者在3个月内检出恶性肿瘤，在子宫内膜癌和胆囊癌患者癌细胞可检测到THSD7A蛋白表达升高，且化疗导致THSD7A抗体下降及蛋白尿水平降低。

2. 基于血清自身抗体的疾病监测

研究表明PLA2R抗体水平与疾病活动相关，且PLA2R抗体水平与蛋白尿呈正相关，与血浆白蛋白浓度呈负相关，抗PLA2R抗体水平升高是持续性高蛋白尿和肾功能下降的独立危险因素。在基线临床特征和抗体水平相似的患者中，他克莫司和利妥昔单抗联合治疗组抗体降低幅度大于环磷酰胺治疗组。研究表明循环抗PLA2R抗体和蛋白尿有助于指导原发性MN肾病患者的个体化美罗华治疗。

研究表明对治疗无反应或未达到缓解的患者抗THSD7A抗体持续升高。

3. 基于血清自身抗体的预后监测

血清抗PLA2R抗体可有效预测治疗反应，抗PLA2R抗体水平在治疗的前3个月急剧下降，在6-9个月后消失，随后12-24个月蛋白尿缓解，治疗结束时PLA2R 抗体水平可以预测长期疗效，抗体复阳或滴度增加可预示疾病复发。治疗后PLA2R抗体阴性的大部分患者可保持5年缓解，而在治疗结束后，抗体阳性的患者在2年内均未缓解。此外，在THSD7A相关MN患者中，抗THSD7A抗体基线水平高的患者临床结局较差，移植时THSD7A抗体滴度高亦与疾病复发相关。

值得注意的是，临床症状的发展可能不仅取决于抗体水平，而且还取决于沉积在上皮下间隙的免疫复合物的数量，抗体通过肾小球基底膜的能力，以及与特定表位及其IgG亚类结合的能力。因此，肾活检仍然是诊断MN的金标准，但自身抗体的检测有助于有活检禁忌症患者的诊断。

0 5 总结与展望

未来的研究需要确定每个抗原和抗体的致病作用，进一步评估这些抗原和抗体在疾病诊断、疾病活动监测和治疗反应方面的作用。

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题图 | veer.com

排版 | 张宁

审校 | 方研

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