右美托咪定对心脏瓣膜置换术患者外周血单核细胞焦亡的影响

本文原载于《中华麻醉学杂志》 2021年第10期

心脏瓣膜置换术是目前治疗心脏瓣膜病的主要方法，该术式已较为成熟[1]。然而体外循环(CPB)及缺血再灌注等因素可诱发机体炎症反应，影响患者预后[2]。右美托咪定除具有麻醉效应外，还可抑制炎症反应，用于心脏瓣膜置换术患者可明显降低围术期炎症反应[3]。细胞焦亡是一种伴随着炎症反应的细胞程序性死亡方式，主要由NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)通路激活[4]。细胞焦亡后细胞膜完整性丧失，并释放促炎性物质，进一步诱发炎症反应[5]。已有研究表明右美托咪定可通过抑制NLRP3/caspase-1通路在多种疾病中发挥抗炎作用[6,7,8]。本研究拟评价右美托咪定对心脏瓣膜置换术患者外周血单核细胞焦亡的影响，进一步探讨其抗炎机制。

资料与方法

本研究已获本院医学伦理委员会批准(批号20190905)，并与患者签署知情同意书。

选择2019年12月至2020年12月本院择期行心脏瓣膜置换术患者44例，性别不限，年龄45~64岁，BMI 18~25 kg/m2，ASA分级Ⅱ或Ⅲ级，NYHA心功能分级Ⅱ或Ⅲ级，LVEF≥45%，近1个月内未发生心肌梗死；无Ⅲ度房室传导阻滞，无心脏手术史，无糖尿病及本研究所用药物过敏病史，无近期急性感染史，无近期使用皮质激素治疗史；肝肾功能未见异常。采用随机数字表法分为2组(n＝22)：右美托咪定组(Dex组)和生理盐水组(NS组)。

常规术前准备，入室后监测ECG、HR、SpO2及患者状态指数(PSI)等，面罩吸氧，建立外周静脉血管通路。Allen试验后局麻下行桡动脉穿刺置管术，监测有创血压。麻醉诱导：静脉注射咪达唑仑0.04~0.06 mg/kg、舒芬太尼0.5~1.0 μg/kg、依托咪酯0.2~0.3 mg/kg、罗库溴铵0.6~1.0 mg/kg，气管插管术后行机械通气，VT 6~8 ml/kg，通气频率12~16次/min，吸呼比1∶2，FiO2 40%~80%，维持PETCO235~45 mmHg (1 mmHg＝0.133 kPa)。诱导后行右颈内静脉穿刺术及漂浮导管置入术，监测CVP及肺动脉压(PAP)，连续监测鼻咽温度与直肠温度。Dex组于常规麻醉诱导后经10 min静脉输注右美托咪定(批号：20061731，扬子江药业集团有限公司)0.5 μg/kg，继之以0.5 μg·kg-1·h-1的速率输注至术毕；NS组以等容量生理盐水替代。维持麻醉：2组患者均静脉输注丙泊酚4~12 mg·kg-1·h-1，吸入七氟烷1.0~1.3 MAC(CPB期间停止吸入)，间断静脉注射舒芬太尼0.5~1.0 μg /kg、罗库溴铵0.3~0.6 mg/kg，维持PSI值25~55。术中通过调整输液速率，检测血气、观察尿量等方法，维持电解质在适宜范围，维持出入量平衡及循环稳定。手术在低温和低流量的CPB下进行。术毕保留气管导管转入ICU治疗，并继续机械通气。术后行PCIA，镇痛药物配方：舒芬太尼2.5 μg/kg+地佐辛0.5 mg/kg+生理盐水至100 ml，镇痛泵参数设置：背景输注速率2 ml/h，PCA剂量0.5 ml，锁定时间15 min，维持VAS评分<4分。患者各项生命体征恢复，达ICU拔管指征，即可拔除气管导管，面罩吸氧。患者各项生命体征平稳，达转出ICU标准，转入普通病房继续治疗。

于麻醉诱导后切皮前(T1)、CPB开始后30 min (T2)、CPB停止即刻(T3)及停止后24 h (T4)时，采集颈内静脉血样2 ml置于促凝管，6 ml置于EDTA抗凝管，4 ℃冰箱保存，6 h内处理。促凝管血样1 000×g离心20 min，取血浆进行指标测定；抗凝管血样采用改良的Ficoll密度梯度离心法提取单个核细胞，重悬于含12%胎牛血清的1640培养液中，经过夜诱导得贴壁单核细胞，刮取单核细胞用PBS制成细胞悬液，采用流式细胞仪检测单核细胞纯度，其纯度>90%，进行指标测定。

ELISA法检测血浆IL-18及IL-1β的浓度。静脉血样离心，取上清，配置标准品工作液；向反应孔加标准品或样品，37 ℃孵育90 min；弃去孔内液体，加入生物素化抗体工作液，37 ℃孵育60 min；洗涤3次，加入酶结合物工作液，37 ℃孵育30 min；洗涤5次，加入底物溶液，37 ℃孵育15 min；加入终止液；酶标仪测定450 mm波长处的光密度值，Origin9-64软件计算IL-18及IL-1β浓度。

采用Western blot法检测单核细胞NLRP3、caspase-1和消皮素-D(GSDMD)表达。裂解单核细胞，提取全蛋白；BCA法进行蛋白定量；配平，变性后-80 ℃冻存；电泳，蛋白上样量为30 μg，半干转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h；加入NLRP3抗体(批号：ab263899，Abcam公司，英国)、caspase-1抗体(批号：ab207802，Abcam公司，英国)和GSDMD抗体(批号：ab210070，Abcam公司，英国)，抗体浓度均为1∶1 000，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min，加入山羊抗兔二抗(批号：A23920，Abbkine公司，美国)，避光孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min，扫膜分析，使用Quantity One软件测定条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值和内参GAPDH条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

记录患者术中丙泊酚、舒芬太尼、去甲肾上腺素的用量、术后机械通气时间及ICU停留时间。

采用SPSS 21.0软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，随机区组设计的计量资料比较采用成组t检验，重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析；计数资料比较采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

Dex组术前取消手术1例，术后二次开胸止血1例，最终纳入分析20例；NS组术后不同意继续参与本研究1例，试验操作不当，血样污染，无法检测指标1例，最终纳入分析20例。该40例患者均顺利完成手术并出院。

2组患者一般情况各指标比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1

两组患者一般情况各指标的比较(n＝20)

与NS组比较，Dex组术后机械通气时间缩短(P<0.05)，术中丙泊酚用量、舒芬太尼用量、去甲肾上腺素用量和ICU停留时间差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2

两组患者术中用药量、术后机械通气时间和ICU停留时间的比较(n＝20，±s)

注：与NS组比较，a P<0.05

与T1时比较，T2~4时2组血浆IL-18与IL-1β浓度升高(P<0.05)；与NS组比较，Dex组T2~4时血浆IL-18与IL-1β浓度降低(P<0.05)。见表3。

表3

两组患者各时点血浆IL-18、IL-1β浓度的比较(pg/ml，n＝20，±s)

注：与T1时比较，a P<0.05　与NS组比较，bP<0.05

与T1时比较，T2~4时2组外周血单核细胞NLRP3、caspase-1及GSDMD表达上调(P<0.05)；与NS组比较，Dex组T2~4时外周血单核细胞NLRP3、caspase-1及GSDMD表达下调(P<0.05)。见表4，图1，图2，图3。

表4

两组患者各时点外周血单核细胞NLRP3、caspase-1、GSDMD表达水平的比较(n＝20，±s)

注：与T1时比较，aP<0.05　与NS组比较，bP<0.05

图1

两组患者各时点NLRP3电泳图

图2

两组患者各时点caspase-1电泳图

图3

两组患者各时点GSDMD电泳图

讨论

本研究以血浆IL-18浓度作为主要指标来评价Dex组和NS组的炎症反应程度。参照文献[9]及预试验结果，T2时Dex组较NS组血浆IL-18浓度降低9 pg/ml，(＝9)有临床意义，按照α＝0.05，β＝0.20，检验效能1-β＝0.80的水准，根据PASS软件，计算出每组需要19例，允许10%脱落率，最终确定每组22例。本研究围术期管理的麻醉医师、外科医师、ICU医师及患者均被设盲。

右美托咪定用于心血管手术患者的推荐剂量范围为0.05~0.50 μg·kg-1·h-1[10]，本研究从患者的安全考虑，麻醉诱导后静脉输注0.5 μg/kg，10 min后以0.5 μg·kg-1·h-1的速度持续输注至术毕。试验过程中未见右美托咪定相关的心动过缓和低血压发生。

生理情况下外周血IL-18和IL-1β水平很低，当机体受到刺激，上述炎症因子的水平会增加，因此外周血IL-18和IL-1β浓度可以反映机体炎症反应程度。此外，IL-18和IL-1β是NLRP3/caspase-1通路的主要效应分子[11]。本研究结果显示，2组手术开始后血浆IL-18和IL-1β浓度升高，提示随着CPB及手术操作等刺激，机体发生剧烈的炎症反应。而Dex组T2~4时血浆IL-18和IL-1β浓度低于NS组，术后机械通气时间短于NS组，表明右美托咪定在此类手术患者中发挥一定抗炎作用，有利于患者早期恢复。2组患者ICU停留时间无差异，可能与术后ICU管理方案相关。

NLRP3/caspase-1通路能被多种病原体及危险信号激活，是固有免疫的重要组分，在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用[12]。研究发现，单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞、上皮细胞及成骨细胞的细胞质内均有NLRP3表达，在炎症感染和内源性刺激作用下，其表达上调[13]。NLRP3被激活后，可以通过凋亡相关斑点样蛋白募集无活性caspase-1，诱导caspase-1前体裂解成有活性分子，而活化的caspase-1可促进IL-18和IL-1β前体的裂解、成熟和释放[14]。在此过程中，活化的caspase-1切割GSDMD氨基端和羟基端的连接体，产生的氨基端片段可靶向作用于细胞膜，增加质膜的通透性，引起炎性细胞程序性死亡，即细胞焦亡[15]。GSDMD是细胞焦亡的关键底物蛋白，有研究表明敲除GSDMD基因可抑制caspase-1介导的炎性坏死[16,17]。本研究结果显示，2组外周血单核细胞NLRP3、caspase-1、GSDMD表达上调，提示在心脏瓣膜置换术患者中，外周血单核细胞细胞焦亡增多，而Dex组T2~4时上述蛋白表达较NS组下调，提示右美托咪定可以抑制外周血单核细胞细胞焦亡。

本研究为小样本、单中心试验，存在一定的临床局限性；本研究未对患者进行长期随访，未观察右美托咪定对患者远期预后的影响。

综上所述，右美托咪定减轻心脏瓣膜置换术患者炎症反应的机制可能与抑制NLRP3/caspase-1通路，减轻外周血单核细胞焦亡有关。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

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