外泌体的载药方法

外泌体的载药方法

通常，药物可以通过两种方法分类为外泌体：主动加载和被动加载。主动加载方法也称为远程或后加载方法，这是一种用分离的外泌体进行药物加载过程的方法。被动加载方法也称为预加载方法，处理从预处理的供体或源细胞分泌载药外泌体。被动加载方法不需要在系统中添加活性物质，主动负荷方法已被证明在实现更高的药物囊泡比方面更有效，因为它具有主动泵送机制。相反，后加载方法比亲水药物更适合疏水性药物。

 （图片出处：National Library of Medicine；doi: 10.3390/cells10081959）

外泌体药物负荷方法。载药外泌体可以在预处理的细胞或组织中分泌，并且可以从细胞分泌的EVS中分离出具有包封药物的外泌体。药物也可以通过主动/被动载药方法加载到现成或分离的外泌体中。

被动加载方法

1. 用靶向外泌体供体细胞孵育药物用所需药物处理靶细胞，然后从预处理的细胞分泌载药外泌体，预处理的SR4987间充质基质细胞中PTX负载外泌体的分泌。在研究中，首先将细胞处理并用低剂量PTX孵育24小时，然后将细胞洗涤并重新接种在带有新鲜培养基的新烧瓶中。最后，48小时后从细胞培养基中分离并收集负载PTX的外泌体。为了释放载药外泌体，预处理的供体细胞可暴露于生物或机械刺激，例如热、缺氧和紫外线或组合。

2. 分离外泌体药物的孵育这种方法称为被动加载方法。药物和外泌体简单地一起孵育一段时间，药物由于浓度梯度而扩散到外泌体中。该方法适用于装载疏水性药物，药物负载效率与药物的疏水性直接相关。Dongmel等人展示了通过孵育方法加载姜黄素的外泌体。将外泌体和姜黄素在PBS中混合，并在22°C下孵育5分钟，并根据不同的蔗糖梯度离心混合物。与游离姜黄素相比，外泌体包封增强了姜黄素的溶解度、稳定性和生物利用度。类似地，通过在室温下在PBS缓冲液中孵育18小时，将酶过氧化氢酶加载到外泌体中。

主动载药方法

1. 用膜透化器孵育该方法使用膜透化剂表面活性剂，如皂苷。简而言之，胆固醇和表面活性剂的相互作用导致外泌体膜通透性。它适用于将亲水小分子加载到外泌体中，比被动孵育方法高11倍，与简单孵育相比，膜渗透法提高了上样效率。

2. 超声处理分离的外泌体与药物混合，然后使用均质器探针进行超声处理。超声加载法的药物负载利用机械剪切力通过变形的膜扩散到外泌体中。超声处理后外泌体膜完整性降低。尽管超声处理后膜微粘度显着降低，但超声处理过程不会影响膜结合蛋白和外泌体的脂质含量。此外，外泌体膜的完整性可以通过在37°C下孵育1小时来恢复。

3. 挤出它是一种后加载方法，利用基于注射器的脂质挤出机并具有苛刻的机械力。简而言之，将目标药物和分离的外泌体在调节温度下加载到具有100至40nm多孔膜的挤出机中，然后将药物与破碎的外泌体膜混合，挤出型药物负载对外泌体的益处。卟啉被加载到三阴性乳腺癌细胞（MDA MB-231）衍生的外泌体中。与孵育法相比，挤压型上样时卟啉的细胞毒性作用更高。结果表明，挤压法负载改变了原始外泌体的zeta电位。挤出工艺的数量有助于有效的药物装载。

4. 冻融循环该方法有三个步骤：将分离的外泌体与药物在室温下孵育给定时间，在-80°C或更低（液氮）下冷冻，最后在室温下解冻。为了更好地载药，上述过程至少重复三个周期。与超声或挤压法相比，冻融加载法的载药量较低。

5. 电穿孔该方法利用电场干扰外泌体的磷脂双层并在其上产生小孔。最有效的电穿孔方案使用750 V和10个脉冲。然后，药物可以通过发达的孔扩散或分类，同时，在加载后回收膜。较大的分子，如核苷酸（siRNA/miRNA）可以通过电穿孔加载方法加载到外泌体中。电穿孔还有助于加载较小的亲水分子。由于与RNA聚集和外泌体不稳定性相关的问题，它具有低负载能力。