科研丨浙大: 多菌灵塑造蚯蚓肠道微生物群并增强耐药基因组 (国人佳作)

编译：微科盟阿曼，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   包括农药杀菌剂在内的几种污染物会增加环境中抗生素抗性基因(ARGs)的丰度。蚯蚓作为环境风险评估的重要生物指标，目前仍被忽视，而杀菌剂多菌灵(CBD)残留对肠道微生物组和耐药基因组的影响尚不清楚。本研究以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)为研究对象，采用鸟枪法宏基因组学和qPCR方法研究CBD对土壤-蚯蚓系统的影响。结果表明，CBD显著干扰细菌群落并富集放线菌门的特定细菌。更重要的是，CBD可以作为一种共选剂提高蚯蚓肠道中ARGs的丰度和多样性，尤其是一些特定类型的ARGs(如多重耐药基因、糖肽、四环素和利福霉素耐药基因)。宿主跟踪分析表明，ARGs主要在放线菌门和变形菌门的某些属中携带。同时，ARGs水平与可移动遗传元件(MGEs)丰度呈正相关，并在CBD处理的宏基因组组装contigs上发现了一些具有代表性的ARGs和MGEs共现模式(如cmx-转座酶和sul1-整合酶)。综上所述，CBD对蚯蚓肠道耐药基因组的增强作用可能是由于其对肠道微生物群的胁迫和MGEs介导的ARGs传播的促进作用，这可能为深入了解广泛使用的农药对土壤中蚯蚓肠道耐药基因组的生态毒理学风险提供了新的见解。    

论文ID

原名：Carbendazim shapes microbiome and enhances resistome in the earthworm gut

译名：多菌灵塑造蚯蚓肠道微生物群并增强耐药基因组

期刊：Microbiome

IF：16.837

发表时间：2022.4

通讯作者：方华

通讯作者单位：浙江大学农业与生物技术学院

DOI号：10.1186/s40168-022-01261-8

实验设计

结果

1 土壤-蚯蚓系统中CBD的消解和生物积累

在土壤-蚯蚓系统中，蚯蚓暴露于不同剂量的土壤CBD中4周。如图1a所示，随着处理时间的延长，蚯蚓体内CBD的生物积累浓度逐渐降低，最终CBD残留量分别为0.09 (NG-CBD1)、0.14 (MG-CBD1)、0.14 (NG-CBD2)和0.19 (MG-CBD2) mg/kg f.w.。土壤中添加粪肥增强了蚯蚓体内CBD的生物积累因子(BAF)(图1b)。CBD在土壤中的消解符合一级动力学方程(0.9402<r<0.9936)，半衰期分别为33.00 d (NS-CBD1)、23.49 d (MS-CBD1)、33.16 d (NS-CBD2)和19.15 d (MS-CBD2)(表S4)。暴露28天后，NS-CBD1、MS-CBD1、NS-CBD2、MS-CBD2最终CBD残留水平分别为0.46 mg/kg、0.37 mg/kg、0.947 mg/kg和0.63 mg/kg(图S1)。蚯蚓生物量在培养28天后有所增加，但CBD处理间蚯蚓存活率没有显著差异(单因素方差分析，p>0.05)，说明土壤CBD处理浓度对蚯蚓没有明显的急性毒性作用。

图1. 不同处理间蚯蚓体内多菌灵的生物积累浓度(a)和生物积累因子(BAF)(b)。NE-CBD1和NE-CBD2分别代表1.0和2.0 mg/kg CBD的未施肥土壤中的蚯蚓样品。ME-CBD1和ME-CBD2分别代表1.0和2.0 mg/kg CBD的施肥土壤中的蚯蚓样品。

2 CBD对肠道菌群的影响

如图2a所示，变形菌门(33.9-49.4%)、放线菌门(26.5-54.6%)、厚壁菌门(7.86-18.2%)和拟杆菌门(0.972-3.38%)为优势菌门，占肠道菌群的90%以上。在门水平上，CBD暴露改变了肠道微生物的组成。与对照组相比，NG-CBD2和MG-CBD2中放线菌门的相对丰度分别增加了111.7%和128.4% (p<0.05)，而MG-CBD2中变形菌门相对丰度显著减少21.6% (p<0.05)。其他菌门(如厚壁菌门和浮霉菌门)的相对丰度在CBD暴露下没有显著变化(p>0.05)。alpha多样性方面，CBD暴露期间，肠道Shannon多样性指数在1.10-1.54之间波动，呈现出刺激-恢复-抑制的趋势(图S3a)。优势菌属(top 50)的热图揭示了CBD暴露下肠道和土壤微生物的不同响应(图S4)。蚯蚓肠道优势菌属为伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、链霉菌属（Streptomyces）、 Microbactertium 、芽孢杆菌属（Bacillus）和无色杆菌属（Achromobacter），土壤中优势菌属为副伯克霍尔德菌属（Paraburkholderia）、贪铜菌属（Cupriavidus）、链霉菌属、伯克霍尔德菌属和假单胞菌属（Pseudomonas）。然而，Mantel检验表明土壤微生物与蚯蚓肠道菌群之间存在显著的相关性(r=0.79，p<0.0001)。值得注意的是，MG-CBD2中伯克霍尔德菌、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和克雷伯菌属(Klebsiella，变形菌门)的相对丰度显著下降(p<0.05)，而链霉菌属(放线菌门)的相对丰度显著增加(p<0.05)(图S5)。然而，随着CBD浓度的增加，蚯蚓肠道中一些放线菌门的菌属相对丰度显著增加，如北里孢菌属（Kitasatospora）、红球菌属（Rhodococcus）、分枝杆菌属（Mycobacterium）和Mycolicibacterium(图2b)。如图S6a所示，基于Bray-Curtis相异度的PCoA分析表明在属水平上各处理的肠道细菌群落沿PCoA 1轴明显分离(p<0.05；ANOSIM)，这也在土壤中发现(图S6b)。

图2. 不同处理间蚯蚓肠道门水平微生物群组成(a)以及属于放线菌门的属(b)相对丰度存在显著差异。NG-CK、NG-CBD1和NG-CBD2分别代表0、1.0和2.0 mg/kg CBD的未施肥土壤中的蚯蚓肠道样品。MG-CK、MG-CBD1和MG-CBD2分别代表0、1.0和2.0 mg/kg CBD的施肥土壤中的蚯蚓肠道样品。

3 CBD对肠道耐药基因组的影响

MG组中ARGs的总丰度显著(p<0.05)高于NG组。此外，还阐明了CBD对蚯蚓肠道中ARGs丰度的提高作用(图3A)。NG-CBD2和MG-CBD2的ARGs总丰度分别为0.039 copies/16S-rRNA，0.142 copies/16S-rRNA，分别为对照的1.77倍和1.93倍。基于对数转化丰度的热图显示，ARGs对主要的13种抗生素产生了耐药性(图3c)。NG-CBD2中某些ARGs(即多重耐药基因、糖肽、四环素、利福霉素、MLSB、氨基糖苷、利胆醇和磺胺类耐药基因)的丰度较对照高1.67-2.46倍。低浓度(1 mg/kg)的CBD能增加特异性ARGs的丰度，如利福霉素抗性基因。在抗生素耐药机制方面，CBD主要增强了占多数(>70%)的抗生素外排泵基因和靶标改变基因(图S7)。在蚯蚓肠道中检测到的ARGs亚型数量从30到155不等，图3d二分网络显示了独有和共有的ARGs，MG-CBD2处理组独有的ARGs最多(如aadA2)，而各处理之间的主要共享基因是多重耐药ARGs。与对照组相比，CBD2处理组ARGs的多样性显著增加(图3b，单因素方差分析，p<0.05)。

CBD对前10个优势ARGs丰度的增强作用如图4a所示。MG-CBD2中mtrA、vanRO、RbpA、tetA(48)、novA、sul1、cmx和tet(42)的丰度分别较对照高1.63-4.04倍(p<0.05)。qPCR方法也证实了CBD对优势ARGs的绝对丰度有类似的提高作用(图4b)。MG-CBD2中sul1、vanRO、mdtB、ceoB、muxB、vanSO、mtrA和mexF的绝对丰度比对照增加了2.00-457.19倍(p<0.05)，其中，MG-CBD2中sul1和vanRO的绝对丰度分别达到5.1×108 copies/g和1.19×108 copies/g。PCoA结果显示，NG-CBD2和MG-CBD2的肠道耐药基因组在x轴上与对照组显著不同(解释了48.32%的总方差)(图S8a)。然而，土壤样品中ARGs的丰度(图S9a)和多样性(图S9b)都没有显著变化(p<0.05)，PCoA结果显示CBD处理之间没有显著的分离(图S8b)。

图3. 比较不同处理间抗生素耐药基因(ARGs)的总丰度(a)和多样性(b)，基于共同对数转化丰度(c)的优势ARGs的热图(c)，以及二分网络显示不同处理间共有和独有的ARGs类型(d)。节点和边根据ARGs类型着色。NG-CK、NG-CBD1和NG-CBD2分别代表0、1.0和2.0 mg/kg CBD的未施肥土壤中的蚯蚓肠道样品。MG-CK、MG-CBD1和MG-CBD2分别代表0、1.0和2.0 mg/kg CBD的施肥土壤中的蚯蚓肠道样品。

图4. 各处理组蚯蚓肠道中优势ARGs(Top 10)的丰度(a)和绝对丰度(b)。NG-CK、NG-CBD1和NG-CBD2分别代表0、1.0和2.0 mg/kg CBD的未施肥土壤中的蚯蚓肠道样品。MG-CK、MG-CBD1和MG-CBD2分别代表0、1.0和2.0 mg/kg CBD的施肥土壤中的蚯蚓肠道样品。

4 CBD扩大了肠道中携带ARGs的细菌宿主范围

如图5a所示，利用Procrustes分析，观察到ARGs与蚯蚓肠道细菌群落之间存在显著的相关性，使用拟合优度检验(M2=0.396，p<0.001，999个排列)。根据Spearman的相关性分析结果，放线菌门的几个属(链霉菌属、Microbactertium、Mycolicibacterium和北里孢菌属等)最有可能是蚯蚓肠道中优势ARGs的来源(图5b)。其中多重耐药ARGs类型最多，共有12个属。此外，进行宏基因组组装分析以追踪ARGs的潜在宿主，结果表明CBD增加了蚯蚓肠道中携带ARGs的细菌宿主的多样性(图5c)。在CBD2处理中，共有21个细菌属被认为是ARGs的潜在宿主，其中微杆菌属（Microbacterium）(n=17)是最常见的ARGs宿主，包括tet (42)，vanRO，tetB(48)，tet (43)，和mtrA，其次是Mycolicibacterium (n=14)、泛菌属（Pantoea）(n=11)、无色杆菌属(n=8)和假单胞菌属(n=6)，几乎都属于放线菌门和变形菌门。此外，在CBD2处理中，多个细菌属携带了多重耐药、四环素和MLSB耐药基因(即mtrA、tet(42)和ErmC)。而在对照中，只有8个细菌属被认为携带ARGs，且构建的网络比CBD处理简单。此外，土壤中ARGs的潜在宿主主要属于变形菌门和放线菌门，在蚯蚓肠道与周围土壤之间发现了一些携带ARGs的共有菌属，即微杆菌属和假单胞菌属(图S10)。

图5. ARGs和细菌群落的Procrustes分析(a)，基于Spearman相关性的优势ARGs和属(>1%)的共现网络分析(b)，以及基于宏基因组组装分析的不同处理间蚯蚓肠道中的ARGs宿主网络(c)。NG-CK、NG-CBD1和NG-CBD2分别代表0、1.0和2.0 mg/kg CBD的未施肥土壤中的蚯蚓肠道样品。MG-CK、MG-CBD1和MG-CBD2分别代表0、1.0和2.0 mg/kg CBD的施肥土壤中的蚯蚓肠道样品。

5 CBD增强了蚯蚓肠道中ARGs和MGEs之间的关联

如图6a所示，CBD暴露(2 mg/kg)和施肥添加均能显著(p<0.05)增加蚯蚓肠道中MGEs的总丰度。质粒、转座子和整合子的丰度分别较对照高1.38、1.55、1.82倍。Pearson相关分析和线性回归分析显示，ARGs的总丰度与质粒和转座子丰度呈显著正相关(r>0.9，p<0.001，图6b)。此外，与其他处理相比，CBD2处理中较多的ARGs(如MLSB、利胆醇和磺胺耐药基因)与MGEs呈正相关(p<0.01)(图S11)。然而，ARGs和MGEs之间的这种正相关并不能直接证明MGEs在ARGs传播中的潜在作用。该研究还分析了contigs中MGEs和ARGs的共现排列，以揭示ARGs在蚯蚓肠道内水平转移的潜力。如表S6所示，在MG样品中发现了11对ARGs和MGEs共现模式，如ARGs-转座酶和ARGs-整合酶，且MG-CBD2共现模式的数量和多样性均高于其他处理组。图6c显示了MG样品中ARGs和MGEs的一些代表性共现模式。在所有处理中，cmx-转座酶均位于同一contig上，且sul1-整合酶和tet(Z)-甲基转移酶同时出现，表明ARGs和MGEs的丰度存在直接相关性。此外，在属于不同质粒片段的contigs上发现了几个ARGs。如图S12所示，CBD2处理组携带ARGs的质粒来源contigs的平均百分比为0.0040-0.0162%，较对照组高2.16-3.51倍。

图6. 不同处理蚯蚓肠道中MGEs的丰度(a)，ARGs和MGEs丰度之间的线性回归分析(b)，以及ARGs和MGEs在contigs上的共现排列(c)。NG-CK、NG-CBD1和NG-CBD2分别代表0、1.0和2.0 mg/kg CBD的未施肥土壤中的蚯蚓肠道样品。MG-CK、MG-CBD1和MG-CBD2分别代表0、1.0和2.0 mg/kg CBD的施肥土壤中的蚯蚓肠道样品。

讨论

蚯蚓因其对污染物较高的生物积累性和敏感性，被认为是环境风险评估的重要生物指标。在本研究中，ME-CBD处理中CBD的BAF较NE-CBD处理高，这可能是由于土壤中的肥料添加改变了蚯蚓CBD的生物利用度。土壤中蚯蚓对CBD的生物积累潜力与土壤理化性质和蚯蚓种类有关。有研究报道，土壤中蚯蚓CBD的生物利用度受到土壤理化性质的影响，如有机质和pH。研究还发现，不同的蚯蚓种类对CBD表现出不同的生物积累能力。

在本研究中，施肥导致人为将耐药基因组引入农业土壤和动物肠道，这与以往的研究一致。土壤中0-2.0 mg/kg浓度的CBD暴露28天对蚯蚓没有明显毒性，这与CBD的LC50一致。然而，CBD暴露显著改变了蚯蚓肠道耐药基因组(p<0.05)，并且观察到几种优势ARGs亚型富集(例如：mtrA，vanRO，RbpA，sul1，tetA(48)和cmx)。这些观察结果表明CBD可以作为一种重要的共选剂来增加肠道微生物的抗生素耐药性。几项类似的研究也报道了一些污染物(如抗生素和重金属)可以增加动物肠道中ARGs的丰度。例如，非抗生素药物卡马西平会提高跳虫肠道的抗生素耐药性，特别是β-内酰胺和多重耐药基因。增强的ARGs主要与CBD暴露下抗生素外排的耐药机制有关。耐多药外排泵(如RND超家族)可以主动排出各种有毒化合物，包括常用的抗生素以及重金属、杀虫剂和染料等非抗生素类物质，从而使多药耐药基因(如mtrA、ceoB和muxB)随着CBD浓度的增加而增强。此外，CBD残留还导致具有其他抗性机制的ARGs增加(例如：vanRO，sul1和cmx)。基于宏基因组组装分析的宿主跟踪结果显示，耐药基因组主要存在于放线菌门的细菌宿主中。已有研究报道，CBD残留会改变细菌群落结构，本研究结果表明，低浓度的CBD (1 mg/kg)可以显著干扰肠道和土壤微生物群落(p<0.05)。肠道菌群的变化与微生物所在土壤的变化有一定的相关性。多项研究报道，包括蚯蚓在内的土壤无脊椎动物的肠道菌群来源于土壤微生物群落。此外，放线菌门的一些菌属在蚯蚓肠道中富集，这与嘧菌酯对线蚓（Enchytraeus crypticus）肠道微生物群落的作用相似。

在CBD暴露下，放线菌的相对丰度增加可能是导致蚯蚓肠道ARGs丰度提高的原因之一。例如，在CBD暴露下微生物细菌属相对丰度的增加可能会导致其中一些ARGs (如vanRO)丰度升高。已有研究报道，CBD可以提高13种ARGs相关细菌属的相对丰度，提高土壤细菌群落对金霉素的抗性。放线菌门中的一些细菌是携带多种ARGs的主要抗生素产生菌，有证据表明放线菌门中的一些ARGs可以转移到病原体中。同时，放线菌在有机物的代谢过程中也发挥着重要作用，其富集可能有助于蚯蚓的健康。多粘菌素B有助于蚯蚓肠道中放线菌的富集，有助于蚯蚓适应胁迫。

此外，通过MGEs进行水平基因转移是ARGs传播的重要机制。本研究采用宏基因组组装和相关性分析，揭示了CBD对蚯蚓肠道中MGEs介导的ARGs传播的潜在促进作用。已证实重金属在环境浓度下促进MGEs介导的ARGs转移。基于组装的contigs，发现在MG样本中普遍存在cmx-转座酶、sul1-整合酶和tet(Z)-甲基转移酶的共现模式，CBD增加了它们的数量和多样性，从而导致ARGs的增强。最近的研究发现氯霉素输出基因cmx通过“carry-back”模式从放线菌转移到假单胞菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属，而sul1与整合子等整合性接合元件有关。

结论

本研究结果表明，CBD可以显著影响蚯蚓肠道微生物群落，富集放线菌门的特定细菌。此外，CBD作为一种共选剂，可以提高蚯蚓肠道中ARGs的丰度和多样性。CBD对蚯蚓肠道耐药基因组的增强作用可能是由于携带ARGs的多种潜在细菌宿主以及促进由MGEs介导的ARGs传播。本研究为广泛使用的农药对生活在土壤中的蚯蚓的肠道菌群和耐药基因组的生态毒理学风险提供了新的见解。