石毓君 | 巨噬细胞，肝纤维化治疗的新希望

巨噬细胞，肝纤维化治疗的新希望

舒于珂1，彭伟2，石毓君1，文天夫2

1. 四川大学华西医院临床病理研究所 卫健委移植工程与移植免疫重点实验室（成都 610041）

2. 四川大学华西医院肝脏外科（成都 610041）

引用本文：舒于珂, 彭伟, 石毓君, 文天夫. 巨噬细胞，肝纤维化治疗的新希望. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(12): 1559-1561. doi: 10.7507/1007-9424.202211004

石毓君

博士，研究员。目前学术任职：中华医学会病理学分会委员；中华医学会器官移植学分会移植病理学组委员；中国医师协会器官移植医师分会组织和细胞移植专业委员会（学组）委员；海峡两岸医药卫生交流协会肝胆胰外科专委会委员；四川省医学会器官移植专委会委员；四川省医学会病理学专委会委员；四川省肿瘤学会肝癌专委会常委。目前取得的主要成果：主持 6 项国家自然科学基金和多项省部级重大课题研究。近年来在 Hepatology、J Hepatol、Cancer Res、Liver Int 等肝病学杂志发表相关论文 40 余篇（影响因子 >20 1 篇、10～20 5 篇、5～10 超过 10 篇）；获发明专利多项

摘  要

近年来许多来自动物模型和临床的证据表明，巨噬细胞在肝纤维化调节中发挥重要作用。利用自体巨噬细胞治疗肝纤维化的安全性和有效性已在临床得到证明并显示了良好的应用前景，但其治疗效果仍然有待提高。硬化肝脏在部分肝脏切除手术后经历了一个细胞外基质显著降解的过程，单细胞测序鉴定出了多个高水平表达不同基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）的促修复性巨噬细胞亚群。未来若能进一步分离鉴定这群巨噬细胞并提高其在肝脏的富集，可使巨噬细胞治疗成为一种高效逆转肝纤维化的策略。

持续性病毒感染、代谢异常、免疫紊乱、慢性中毒等导致全球每年有110多万人死于终末期肝硬化，其中半数以上发生在中国[1]。肝硬化还是原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）的独立危险因素，约80% 的 PLC患者有不同程度的肝硬化[2]。抑制甚至逆转肝纤维化和硬化一直是肝病研究领域的热点，迄今仍未取得显著进展，肝移植几乎是唯一有效的治疗手段。抗纤维化治疗主要包括去除病因、抑制细胞外基质（extracellular matrix，ECM）产生细胞 ［主要是肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）、肌纤维母细胞（myofibroblast，MFB）］ 的活化以及促进ECM的降解。针对病因的治疗（例如抗病毒或戒酒）能在一定程度上减轻肝组织的炎症和纤维化，但也并不能完全终止纤维化的进程[3]。尼达尼布（Nintedanib）等广谱受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）抑制剂可有效抑制炎性细胞和肺纤维母细胞相关细胞因子的分泌、通路的活化以及ECM分泌，对某些原因引起的肺纤维化具有良好的治疗作用。然而，这类药物只能延缓纤维化的进程，无法促进ECM的降解来逆转纤维化[4]。纤维化时不仅仅是ECM量的堆积，ECM中的100余种成分还不断地进行着交联反应（cross-link），交联后的ECM很难被降解，抗交联酶如赖氨酰氧化酶样2（lysyl oxidase-like 2）单克隆抗体的临床前试验显示出一定的应用前景，但当交联已充分发展，纤维化将进入不可逆阶段（point of no return）[5-6]。事实上，临床绝大部分患者就已经进入了这一阶段，在药物治疗没有明显突破的情况下，包括间充质干细胞及其衍生品在内的生物治疗手段被寄予厚望，但效果仍广受争议[7-8]。

越来越多的研究表明，巨噬细胞在肝纤维化逆转中有着至关重要的作用，巨噬细胞治疗是目前研究最广泛且被多数研究者认为具有发展前景的逆转肝纤维化的方式。肝脏中的巨噬细胞有两大来源，在稳定状态下，卵黄囊来源的肝脏中常驻的Kupffer细胞构成了肝脏巨噬细胞的主要部分。在肝脏遭受损伤时，循环单核细胞向肝脏募集并分化成熟，是肝脏巨噬细胞的主要来源[9]。肝脏巨噬细胞在肝纤维化过程中发挥双重作用[10]。纤维化早期，巨噬细胞通过分泌转化生长因子-β（transforming growth factor- β，TGF-β）等生长因子，起促纤维化作用，还能通过分泌多种趋化因募集更多的炎症细胞，加重组织损伤和纤维化，在这个阶段抑制巨噬细胞活化能减轻纤维化程度。巨噬细胞在ECM降解中同样发挥重要作用。在小鼠实验中发现，外周血中进入肝脏的单核-巨噬细胞发生表型转换，淋巴细胞抗原6复合物（lymphocyte antigen 6 complex，Ly-6C）高表达细胞（记为Ly-6Chi）转化为Ly-6C低表达细胞（记为Ly-6Clo），后者高水平表达基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMP）9、13等纤维降解蛋白，显著促ECM降解，也被称为促修复性巨噬细胞（restorative macrophages）。在此时清除巨噬细胞将显著抑制ECM的降解。Ly-6Chi与Ly-6Clo细胞与M1型和M2型巨噬细胞并非一一对应，更可能是介于二者之间的一种表型[11]。

人体中没有与小鼠Ly-6C对应的抗原，通常认为循环中的Ly-6Clo细胞与人CD14+CD16+细胞最为吻合[3, 12]。但人CD14+CD16+细胞在肝脏具有促炎活性，跟小鼠Ly-6Clo细胞的作用相反。但同时，人CD14+CD16+细胞又表现出吞噬活性，能降解并清除ECM，这又与小鼠Ly-6Clo细胞一致。无论如何，人体内肯定存在一群能逆转纤维化的巨噬细胞，越来越多的证据表明这群细胞来自于骨髓单核细胞并且已完全分化成熟。近年，Moroni等[13]分离肝硬化患者外周血单核细胞，在体外经巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor， M-CSF）诱导培养1周，磁珠分选CD45+CD14+25F9hi细胞（107-9个）后经外周输入患者体内，随访1年后，9例患者中有6例终末期肝病评估（model for end-stage liver disease，MELD）评分下降，反映肝纤维化的指标 ［瞬时弹性超声、血清增强型肝纤维化（enhanced liver fibrosis，ELF）评分、胶原降解标志物Ⅲ型胶原前肽（N-terminal propeptide of type Ⅲ collagen，Pro-C3）、Ⅲ 型胶原蛋白降解产物（C3M）等］ 均有所下降，目前该研究已进入Ⅱ期临床试验。输入未经诱导的外周血单核细胞则缺乏降解 ECM 的能。同样，骨髓中的细胞（CD133+CD34+）经 G-CSF 刺激后，移植入患者体内也未见有改善纤维化的作用，其 Ⅱ期临床试验宣告失败[14]。

Moroni 等的研究成果为将自体外周血单核细胞用于抗肝纤维化治疗展示了乐观的应用前景。然而，由于输细胞数量不足、非肝脏定点输入或是不只一种细胞或细胞亚群参与了 ECM 的降解，其纤维的降解程度仍差强人意，也缺乏病理学证据。那么是否有促进单核细胞在肝脏募集并驱动其向促修复性巨噬细胞亚型分化的方法呢？近年的几项研究也许能给我们带来提示。通常认为，由于假小叶周边纤维屏障的存在，肝细胞的扩增会受到限制，但在 CCl4小鼠肝硬化模型中，实施部分肝切除术（partial hepatectomy，PH）以诱导肝再生，再生结束后纤维组织被显著降解，假小叶结构明显消失。在PH后早期，我们通过单细胞测序的确鉴定出多个高水平表达不同MMPs的巨噬细胞亚群。临床上，肝硬化背景的肝癌患者在接受手术切除后，残肝能在短期内迅速增大，这种增大不可能单纯依靠肝细胞的代偿肥大，还有数量的显著增加。在接受联合肝脏分割和门静脉结扎的分阶段肝切除术（associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS）治疗的患者，对比两次手术中获取的肝组织，我们同样惊讶地发现仅仅半个月的时间间隔，肝组织中的纤维组织已被明显吸收，炎症反应也显著改善。我们推测在PH后，生长因子和趋化因子被大量释放，外周血单核细胞迅速向肝脏募集并分化成熟，在肝再生中发挥重要作用，其中就包括降解ECM。

不少基础研究和临床发现都证实肝纤维化甚至肝硬化是可逆的，是有可能人为实现的。骨髓来源的促修复性巨噬细胞在肝脏的大量募集并分泌MMPs等降解ECM，可能是逆转肝纤维化的重要机制。先前所述的用于纤维化治疗的CD14+25F9+细胞只是成熟巨噬细胞的一个亚群，其他细胞亚群是否有相似功能还有待揭示。我们也许可以通过PH等外科手段实现恢复性巨噬细胞向肝脏的募集与分化，也可通过介入手段将细胞输入到肝脏局部，成倍地提高其在肝脏的富集。可以想象，未来通过谱系示踪、单细胞测序以及新兴的时空转录组测序等技术，鉴定促修复性巨噬细胞的亚群组成、明确其分化路径和调控机制，在此基础上实现体外的大量定向诱导扩增，将有望为肝硬化治疗带来新的希望。

重要声明和参考文献略。

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