鞘内移植MSC抑制缺血再灌注损伤脊髓RIPK1表达并改善神经功能修复

王永洪1,2 徐勇2 马保新2 贾俊香1

1厦门大学附属妇女儿童医院（厦门市妇幼保健院）麻醉科，厦门 361003；2厦门大学附属中山医院麻醉科，厦门 361004

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(12):1240-1245.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20220903‑00689

 基金项目 

2018年福建省卫生计生中青年骨干人才培养项目（2018‑ZQN‑86）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究探讨鞘内移植充质干细胞（MSC）对缺血再灌注损伤大鼠脊髓化受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）表达及神经功能的影响。 

1 资料与方法     

1.1　MSC获取、培养及鉴定

腹腔注射4%苯巴比妥钠40 mg/kg麻醉，穿刺胫骨获取骨髓，采用Percoll（1.073 kg/L）分层液梯度离心，分离提取其有核细胞成分进行培养（37℃，5%CO2），培养基为：DMEM/F12、20%胎牛血清和苄青霉素（108U/L）。MSC在培养皿中贴壁生长，3 d以后更换培养基，用PBS清洗2次，去除不贴壁细胞，继续培养，每3天换液1次。MSC 50%以上融合，传代3~5代以纯化细胞。用流式细胞仪检测MSC表面细胞标志CD29、CD90、CD34、CD45进行MSC鉴定。

1.2　动物模型及实验分组

SD大鼠腹腔注射4%苯巴比妥钠40 mg/kg麻醉，参照文献制作脊髓缺血再灌注损伤（SCII）模型。连续监测心率，左颈总动脉置管测近端动脉血压，股动脉置管测远端血压。直肠内置入温度传感器监测体温，应用电热毯维持体温38.5 ℃。耳缘静脉留置导管针作为输液通路，术中输注复方乳酸钠4 ml·kg−1·h−1。正中开腹，游离显露肾动脉以下的腹主动脉，全身肝素化（200 U/kg）后，肾动脉下1 cm处阻断腹主动脉30 min（完全阻断的标准为远端动脉压力低于20 mmHg），制作SCII模型成功。

50只SD大鼠按随机数字表法分为5组（每组10只）：正常组（Sham组），大鼠开腹游离腹主动脉后立即关腹，不做腹主动脉阻断；对照组（Con组），造成SCII后鞘内不做任何处理；PBS组，造成SCII后鞘内注射等容量PBS液；坏死性凋亡抑制剂（Nec‑1）组，造成SCII后静脉注射Nec‑1；MSC组，造成SCII后鞘内注射MSC。SCII第2天，采用比索比蒂布雷斯纳汉下肢运动功能评分法和下肢体感诱发电位（SSEP）对大鼠下肢运动功能进行测定，然后取脊髓标本进行免疫组织化学和Western blot实验。

1.3　鞘内注射技术

收获培养细胞，悬浮于0.4 ml PBS。SCII后于L5/6间隙水平用16 G针穿刺，将已经消毒的PE‑10导管置入蛛网膜下腔，缓慢抽出等量脑脊液后注入细胞悬液（MSC组细胞悬液中含有1×108细胞，PBS组注入等容量PBS）。移植后保持头高脚低体位1 h。

1.4　SSEP测定

应用体感诱发电位仪检测大鼠下肢SSEP。按国际脑电图学会制定的系统，仿人体部位放置记录电极（两耳连线与头颅冠状线之交点的前方）、参考电极（后脑部），刺激电极捆扎于一侧下肢腓肠肌外侧的皮肤上，接地极置于腹部，电极周围以温盐水湿润，极间阻抗<5 Ω，刺激强度1.5 mA，刺激频率1.5 Hz，叠加100次。记录下肢SSEP的P1波和N1波潜伏期和波幅（P1/N1）。

1.5　免疫组织化学法检测脊髓RIPK1阳性神经元

苯巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠（每组5只），左心室穿刺，500 ml生理盐水快速灌注，再以冷400 ml 4%多聚甲醛先快后慢灌注约2 h。按照参考文献进行L4/5脊髓取材、固定、冰冻切片、冲洗、孵育抗体、染色等进行免疫组化实验；最后漂洗、贴片、干燥、脱水、透明，用中性树胶封固组织切片。选5张切片在100倍镜下相同的解剖部位截取同样大小视野记录阳性神经元数目。

1.6　Western blot法检测脊髓RIPK1蛋白水平

苯巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠（每组5只），4 ℃环境中迅速切开椎板，取出L4/5脊髓0.3 cm，置液氮中然后转移至−70 ℃冰箱保存。参照文献分离细胞质和细胞质蛋白后进行电泳转膜，成功后用3%牛血清封闭3 h，再加大鼠RIPK1抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜，用Tris缓冲液吐温20冲洗15 min×3次后加入碱磷酶标记鼠抗小鼠IgG（1∶500），室温摇床孵育1.5 h，最后TBST冲洗15 min×3次，加显色剂使条带显色。所有条带用Image软件进行半定量分析，以目的蛋白与内参β‑tubulin的比值表示目的蛋白水平。

2 结果

2.1　MSC细胞培养及流式细胞仪鉴定

取融合50%以上的第3~5代MSC在显微镜下观察，绝大部分细胞呈纤维梭状集落贴壁生长。采用流式细胞仪对细胞进行鉴定分析得出：CD29表达率为100%，CD90表达率为99.6%，CD34表达率为0.7%，CD45表达率为1.0%。见图1。

2.2　各组大鼠下肢运动功能评分比较

与Sham组比较，Con组、PBS组、Nec‑1组和MSC组大鼠下肢运动功能评分均下降（P<0.05）。与Con组比较，Nec‑1组和MSC组大鼠下肢运动功能评分增加（P<0.05）。与Nec‑1组比较，MSC组大鼠下肢运动功能评分增加（P<0.05）。见图2。

2.3　各组大鼠下肢SSEP的P1波、N1波潜伏期和波幅比较

与Sham组比较，Con组、PBS组、Nec‑1组、MSC组大鼠下肢SSEP的P1波、N1波潜伏期延长，波幅降低（P<0.05）；与Con组比较，Nec‑1组、MSC组大鼠下肢SSEP的P1波、N1波潜伏期缩短，波幅升高（P<0.05）；与Nec‑1组比较，MSC组大鼠下肢SSEP的P1波、N1波潜伏期缩短，波幅升高（P<0.05）。见图3。

2.4　各组大鼠RIPK1阳性神经元数目比较

与Sham组比较，Con组、PBS组、Nec‑1组和MSC组脊髓RIPK1阳性神经元数目增多（P<0.05）；与Con组比较，Nec‑1组和MSC组脊髓RIPK1阳性神经元数目减少（P<0.05）；与Nec‑1组比较，MSC组脊髓RIPK1阳性神经元数目增多（P<0.05）。见图4。

2.5　各组大鼠RIPK1蛋白水平比较

与Sham组比较，Con组、PBS组、Nec‑1组和MSC组脊髓RIPK1蛋白水平升高（P<0.05）；与Con组比较，Nec‑1组和MSC组脊髓RIPK1蛋白水平降低（P<0.05）；与Nec‑1组比较，MSC组脊髓RIPK1蛋白水平升高（P<0.05）。见图5。

3 讨论

本研究中采用的MSC是采集大鼠胫骨骨髓MSC进行分离培养，取融合50%以上的第3~5代MSC在显微镜下观察，绝大部分细胞呈纤维梭状集落贴壁生长。采用流式细胞仪对细胞表面标记物CD29、CD90、CD34和CD45进行分析鉴定：CD29表达率为100%，CD90表达率为99.6%，CD34表达率为0.7%，CD45表达率为1.0%。此结果表明本研究培养的MSC符合国际细胞治疗协会标准。研究发现：鞘内移植MSC后第2天，SCII大鼠下肢运动功能有所改善，而且下肢SSEP潜伏期缩短，波幅升高，鞘内移植MSC促进了SCII大鼠神经功能修复。有学者认为MSC移植后增强了脊髓神经元的抗凋亡作用，从而促进缺血再灌注损伤脊髓神经功能修复。目前研究认为RIPK1是介导细胞凋亡和和程序性坏死的关键元件，本研究也发现与Sham组比较，Con组脊髓RIPK1蛋白水平增高，下肢运动功能评分减少，SSEP的P1波和N1波潜伏期延长，波幅降低；而Nec‑1组抑制了脊髓RIPK1表达，同时大鼠下肢运动功能评分增加，SSEP的P1波和N1波潜伏期缩短，波幅增高；由此可知脊髓RIPK1的表达参与了SCII的形成。本研究中鞘内移植MSC后：SCII大鼠脊髓RIPK1阳性神经元数目减少，脊髓RIPK1蛋白水平降低的同时大鼠下肢运动功能评分增加，下肢SSEP的P1波和N1波潜伏期和波幅也显著改善。

由此表明MSC鞘内移植后可能通过抑制脊髓RIPK1表达促进缺血再灌注损伤脊髓神经功能修复。以往研究认为抗炎、抗凋亡是MSC移植改善缺血再灌注损伤脊髓神经功能的机制之一。MSC移植可能阻断凋亡通路，尤其是caspase‑8被抑制后，细胞内产生复合物Ⅱb，包含磷酸化的RIPK1、RIPK3及混合系激酶域样蛋白，诱导细胞发生程序性坏死。RIPK1位于激酶域活化环内的第161位丝氨酸及其T环可发生自身磷酸化，从而激活RIPK1的活性。RIPK1位于复合物Ⅱa/b中，其抗凋亡域调控RIPK1介导凋亡或程序性坏死。本研究应用Nec‑1抑制缺血再灌注损伤脊髓RIPK1表达，却不能完全改善脊髓神经功能，甚至没有鞘内移植MSC的效果好。由此表明MSC防治SCII机制复杂，以往有研究认为MSC鞘内移植还可能通过分泌各种神经营养因子促进髓鞘的再生，促进局部血管新生和血管重建，改善轴突再生的微环境，从而减轻SCII。

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