科研丨华农: 互利共生通过调节昆虫产卵偏好促进真菌繁殖(国人佳作)

编译：微科盟阿Z，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   青霉菌和桔小实蝇是柑橘类果实的主要病原菌和害虫，因为它们都会对柑橘生产造成严重损失。然而，它们在柑橘类果实共栖中的相互作用仍然难以捉摸。本研究揭示了青霉菌和桔小实蝇之间的互惠关系。我们发现昆虫的行为可以促进真菌病原体进入果实，而真菌病原体反过来促进昆虫的适应性。更具体而言，青霉菌可以利用桔小实蝇产卵器留下的开口，被青霉菌污染的成年桔小实蝇可以将真菌传播到新的地点。此外，真菌释放的挥发性物质可以吸引妊娠的桔小实蝇到感染部位产卵。这种真菌和桔小实蝇能够建立相互作用，正如在整个幼虫阶段的桔小实蝇肠道中存在的青霉菌DNA所揭示的那样。青霉菌似乎通过提供吡哆醇(B族维生素之一)来提高桔小实蝇的羽化率并缩短其羽化时间。与之前报道的果蝇的强烈回避和埃及伊蚊对青霉菌的吸引力不同，我们的结果揭示了青霉菌和桔小实蝇之间互利共生的一种新模式，通过这种模式，昆虫和真菌都能获得益处，以促进其繁殖。    

论文ID

原名：Mutualism promotes insect fitness by fungal nutrient compensation and facilitates fungus propagation by mediating insect oviposition preference

译名：互利共生通过真菌营养补偿促进昆虫适应性，并通过调节昆虫产卵偏好促进真菌繁殖

期刊：The ISME Journal

IF：11.217

发表时间：2022.4

通讯作者：钟国华，易欣

通讯作者单位：华南农业大学

DOI号：10.1038/s41396-022-01237-4

实验设计

结果

1 接种桔青霉菌的基质吸引妊娠的雌性桔小实蝇产卵

真菌挥发性有机化合物在昆虫与真菌的相互作用中起着重要作用，并可以通过作为引诱剂或驱虫剂来影响昆虫的行为。因此，我们首先研究了桔小实蝇对柑橘类果实的一种典型致病真菌桔青霉菌气味的行为反应和产卵偏好(图1a)。在诱捕试验中，我们发现非妊娠雌性和雄性(羽化后20天)对桔青霉菌定植的柑橘表现出强烈的偏好(图1b和补充图1a)。这一结果与Stensmyr等人之前的一项研究一致，该研究表明，土臭素(一种来自青霉菌的挥发性化合物)在桔小实蝇中引发先天性回避。然而，我们也注意到，妊娠的雌性桔小实蝇更喜欢含有感染桔青霉菌的柑橘的小瓶(图1b和补充图1a)。接下来，我们质疑妊娠的桔小实蝇是否也喜欢将感染桔青霉菌的柑橘作为产卵地点。不出所料，产卵偏好试验表明，妊娠雌蝇倾向于在含有受桔青霉菌感染的柑橘的小瓶中产卵(图1c)。为了排除柑橘的气味，我们通过在PDA培养基上呈现桔青霉菌来重复相同的行为反应和产卵偏好测试。同样，我们观察到雄性和非妊娠雌性桔小实蝇对含有桔青霉菌素的小瓶表现出回避(图1d和补充图1b)，但妊娠雌性桔小实蝇更喜欢选择在含有桔青霉菌素的小瓶培养基中产卵(图1d、e和补充图1b)。总之，这些数据表明，桔青霉菌对桔小实蝇的行为反应和产卵偏好有不同的影响。由于这些实验中的桔小实蝇是在人工饲料中饲养的，而且之前没有接触过青霉菌素，因此我们得出结论，这种对桔青霉菌的行为是先天的。

图1 桔小实蝇对桔青霉菌的行为反应。a 行为分析的示意图，包括诱捕分析(左)和产卵偏好分析(右)。b 对成年桔小实蝇进行诱捕分析，在一侧装有无菌柑橘的小瓶(对照)和对角线一侧装有桔青霉菌定殖柑橘的小瓶(处理过的)的小瓶中(n=8-9个独立实验，每个实验中分析15只桔小实蝇)。对不同状态下的桔小实蝇(妊娠雌蝇、非妊娠雌蝇、雄蝇)分别进行检测，并计算相应的吸引指数(A.I.)。c 柑橘和感染桔青霉菌的柑橘之间的产卵偏好试验。计数卵数并计算产卵指数(O.I.)(n=9个独立实验，每个实验分析50只妊娠雌蝇)。d 在无菌培养基(对照)和桔青霉菌定殖培养基(n=7-8个独立实验)之间进行的桔小实蝇的诱捕试验。e 培养基和接种桔青霉菌的培养基之间的产卵偏好测定(n=6个独立实验)。数值是重复的平均值(±SEs)。统计比较基于Students’s t检验。结果的显著性水平设定为**p<0.01，***p<0.0001。

2 三种青霉菌株产生土臭素作为非妊娠桔小实蝇的驱虫剂

为了进一步确定其他青霉菌株是否会在桔小实蝇中引发类似的行为反应，我们使用三种青霉菌株(包括Penicillium expansum、Penicillium citrinum和Penicillium italicum)进行了诱捕试验，发现接种了这三种青霉菌株的培养基都会对未妊娠雌性和雄性桔小实蝇引起显著的回避，但引发了妊娠雌性的强烈吸引力(图2a和补充图2a-c)。由于从青霉菌中鉴定出土臭素是许多昆虫的有效驱虫剂，并且为了确认这些青霉菌株上是否存在土臭素，我们分别对接种在标准PDA培养基上的三株青霉菌株的样品进行了GC-MS分析。以空白PDA培养基为对照，去除空白培养基中的臭味。我们通过将质谱与NIST光谱库中的质谱进行比较，分析了己烷提取物的色谱图(图2b和补充表S2)。如GC-MS图谱所示，在所有测试的青霉菌株中都鉴定出了土臭素(峰30)(图2b和补充表S2)。一个看似合理的假设是，土臭素发出青霉菌存在的信号，并对非妊娠的桔小实蝇起到驱避作用，类似于其在先前报告中的功能。接下来，我们使用10 μl土臭素(10-5稀释度，出现在滤纸(1厘米×3厘米)上的天然青霉菌株和昆虫接受范围内的浓度)进行了相同的诱捕试验。与之前的研究一致，不含土臭素的基质吸引了更多的非妊娠桔小实蝇和雄桔小实蝇，而妊娠雌桔小实蝇没有表现出对土臭素的回避(图2c和补充图2d)。妊娠雌蝇对土臭素的电生理反应也比雄性和非妊娠同胞雌蝇弱(图2d和补充图3)，表明土臭素感应减弱。

在黑腹果蝇中，土臭素激活了一类表达嗅觉受体Or56a的感觉神经元，因此我们假设桔小实蝇对土臭素的感知是由同一受体介导的。我们首先分析了三种Or56a直系同源基因在桔小实蝇中的表达(Or7、Or21和Or25)，发现与非妊娠雌性相比，妊娠雌性的Or7和Or21表达显著降低(图2e)。为了验证它们在土臭素感知中的作用，我们在未妊娠的雌性中沉默了这些基因，这在很大程度上消除了对土臭素的回避(图2f和补充图2e和4)。在妊娠雌性中，这些基因的敲除不会影响雌性对土臭素的行为(图2g和补充图2f和4)。因此，我们得出结论，Or7、Or21和Or25是非妊娠期桔小实蝇对土臭素的感知和厌恶所必需的，这些Ors的下调可能是妊娠期雌性对土臭素厌恶反应减弱的原因。

图2 青霉菌株引起的厌恶是由于非妊娠雌性体内存在土臭素，而在桔小实蝇中被Ors感知到。a 分别在培养基和接种了三种青霉菌株的培养基之间进行诱捕试验得出的桔小实蝇吸引指数(A.I.)(n=6个独立实验，每个实验分析15只桔小实蝇)。分别检查不同状态下的桔小实蝇(妊娠雌蝇、非妊娠雌蝇、雄蝇，羽化后20天)，并计算各自的吸引指数。b 三株青霉菌释放的头部空间的代表性气相色谱图痕迹。通过与合成标准进行比较，进一步确认了土臭素、芳樟醇、3-蒈烯和D-柠檬烯。c 对照溶剂甲醇和土臭素之间的诱捕试验对妊娠、非妊娠雌性和雄性果蝇的吸引指数。e 妊娠和非妊娠雌性中土臭素反应性Ors的表达水平。f 通过溶剂和土臭素之间的诱捕试验，研究注射DEPC水、DSGFP和dsRNA的非妊娠雌蝇的吸引指数。g 通过溶剂和土臭素之间的诱捕试验(n=6个独立实验)，研究注射DEPC水、dsGFP和dsRNA的妊娠雌蝇的吸引指数。根据Students’s t检验，分别对个体处理组和对照组进行统计学比较。结果的显著性水平设定为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、***p<0.0001。 

3 在有青霉菌的基质上产卵可提高桔小实蝇后代的适应性

接下来，我们测试了其他青霉菌株是否也吸引了桔小实蝇的产卵，并确定是否是由嗅觉通路控制了对青霉菌株的产卵吸引力。我们发现，注射了dsGFP的妊娠雌蝇倾向于在接种了不同菌株的青霉菌的基质中产更多的卵，而注射了dsOrco的妊娠雌蝇则不再有这种偏好(图3a)。这些结果暗示了产卵偏好对嗅觉系统的依赖性。鉴于微生物挥发物在桔小实蝇产卵偏好中的重要作用，我们筛选了青霉菌株的挥发物谱，并鉴定了三种青霉菌株通常产生的挥发性有机化合物。在这些真菌菌株的样品中鉴定出芳樟醇、3-蒈烯、D-柠檬烯和6-戊基-2H-吡喃-2-酮(峰4、5、13、32)(图2b和补充表S2)。然后，我们使用与之前研究中使用的浓度相匹配的浓度(在1 cm×3 cm滤纸上使用10 μl/10 μl稀释液)研究了这些化合物在产卵偏好中的作用。四种气味的混合物对妊娠雌性的产卵偏好最强，芳樟醇、3-蒈烯和D-柠檬烯单独或两种气味的混合物对雌性的产卵偏好相对较弱。然而，6-戊基-2H-吡喃-2-酮不能吸引妊娠桔小实蝇产卵(图3b)。进一步的产卵偏好试验表明，妊娠蝇对这三种活性化合物的产卵偏好呈剂量依赖性(图3c)。 为了进一步探索对桔小实蝇中青霉菌株发出的气味的感知，我们对这些气味进行了一系列诱捕试验和EAG测量。仅芳樟醇、3-蒈烯或D-柠檬烯单独使用就足以引起妊娠雌蝇、非妊娠雌蝇和雄蝇的吸引力(图3d)。然而，添加土臭素强烈抑制了非妊娠和雄性桔小实蝇对这些气味的吸引力，而妊娠雌性桔小实蝇的偏好保持不变(图3d)。EAG测量显示，妊娠果蝇对芳樟醇、3-蒈烯、D-柠檬烯和混合气味产生强烈的电生理反应，无论是否含有土臭素，并且对这些气味(芳樟醇、3-蒈烯和D-柠檬烯)的反应显著高于非妊娠雌蝇和雄蝇(图3e和补充图5)。虽然我们不能排除其他挥发性和非挥发性化合物的可能作用，但这些结果表明，这些化学物质至少部分介导了妊娠桔小实蝇对青霉菌株的产卵偏好。

由于非妊娠的桔小实蝇表现出对青霉菌的回避，因此我们假设在含有青霉菌的基质上产卵可能会给后代带来发育优势。妊娠雌蝇在含有或不含桔青霉菌的基质上产卵后，我们监测了这些桔小实蝇的发育，包括幼虫(蛹)的生长速度和发育持续时间。我们发现，孵化率、化蛹率、卵持续时间、幼虫持续时间和化蛹期不受桔青霉菌的影响，而羽化期显著缩短，羽化率显著高于在没有桔青霉菌的基质上产卵的果蝇(图3f)。昆虫和微生物之间的许多联系都是基于营养的，这使得这些昆虫，尤其是它们的幼虫，能够在营养不良的条件下生存。由于大多数昆虫缺乏从中枢代谢的前体合成B族维生素的遗传能力，我们假设桔青霉菌可能产生某些B族维生素，以支持桔小实蝇的发育。然后，我们通过HPLC-MS测量了B族维生素的含量，发现在有或没有桔青霉菌的基质中发育的幼虫样品间，硫胺素、核黄素、烟酸、生物素和叶酸的浓度间具有可比性，而在接种桔青霉菌的幼虫样品中，吡哆醇的水平显著较高(补充图6)。微生物试验进一步证实，从接种桔青霉菌的基质上产卵发育而来的新孵化和成熟幼虫显示出比对照组更高的吡哆醇滴度(图3g)。此外，补充吡哆醇(0.1 ng/ml)可以重现桔小实蝇在含有桔青霉菌的基质上发育的情况(图3h)。因此，我们得出结论，雌性在接种桔青霉菌的基质上产卵后，子代羽化率的提高可能是因为吡哆醇水平较高所致。

图3 真菌有利于桔小实蝇的发育。a 分别在含或不含三株青霉菌的基质之间，对注射dsGFP或dsOrco的妊娠雌桔小实蝇进行产卵偏好测定。计数卵数并计算产卵指数(O.I.)(n=6个独立实验，每个实验分析50只妊娠雌蝇)。b 妊娠雌性对三株青霉菌中四种已鉴定挥发物的不同组合的产卵偏好分析(10 μl 10-5气味剂稀释)(n=6个独立实验，每个实验分析50只妊娠雌蝇)。c 不同浓度的化学品和溶剂对照之间的产卵偏好分析(n=10个独立实验)。d 通过鉴定化合物(10 μl 10-5气味剂稀释)之间的诱捕试验得出的桔小实蝇吸引指数(A.I.)和溶剂(n=6个独立实验，每个实验分析15只桔小实蝇)。分别检查不同状态下的桔小实蝇(妊娠雌蝇、非妊娠雌蝇、雄蝇，羽化后20天)，并计算各自的吸引指数。e 桔小实蝇对不同化学物质反应的EAG测量。d和e的统计比较基于单因素方差分析，不同字母表示显著差异，p<0.05。f 比较在有和没有桔青霉菌的基质上产卵的桔小实蝇的性能。妊娠桔小实蝇在有或没有桔青霉菌的基质上产卵后，计算孵化率、化蛹率和羽化率(上)，并监测卵期、幼虫持续时间、化蛹期和羽化期(下)(n=3个独立实验，每个实验分析20只桔小实蝇)。g 在含有或不含桔青霉菌的基质上产卵的卵发育的幼虫中吡多醇滴度(n=6个独立实验，每个实验分析20个幼虫)。h 比较幼虫饮食中添加吡哆醇的桔小实蝇和对照饲料中饲养的桔小实蝇(不添加吡哆醇)的性能。计算化蛹率和羽化率(上)，测量幼虫持续时间、化蛹期和羽化期(下)(n=3个独立实验，每个实验分析20只桔小实蝇)。数值是重复的平均值(±SEs)。统计比较基于Students’s t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，**p<0.0001。

4 从幼虫期到蛹期桔青霉菌在肠道中的持久性

为了检测桔小实蝇肠道中是否存在桔青霉菌，我们使用针对桔青霉菌DNA的探针进行了FISH。结果表明，在幼虫的肠道中可以观察到桔青霉菌的特异性染色信号(图4a)。通过qRT-PCR的定量显示，含有桔青霉菌的基质在第1天的幼虫中的桔青霉菌DNA含量是对照组(幼虫在没有桔青霉菌的基质上从卵发育而来)的97.30倍(图4a)。桔青霉菌在整个幼虫期持续存在于肠道中(比7-d幼虫的对照高135.28倍)(图4b)，蛹中的桔青霉菌水平降低(比对照组高5.32倍)(图4c)。然而，桔青霉菌似乎从成年阶段的肠道中被清除(图4d，e)。这些结果表明，桔青霉菌可以被桔小实蝇幼虫摄取，并持续到蛹期。

图4 不同发育阶段肠道中桔青霉菌DNA的荧光原位杂交分析。a-f 通过FISH(上图)和qRT-PCR(下图)在不同阶段的桔小实蝇肠道中鉴定和定量桔青霉菌。10×和60×图中的条形分别代表500 μm和50 μm。白色方框表示真菌持续存在的区域。数值是五次重复的平均值(±SEs)。统计比较基于Students’s t检验，*p<0.05。

5 桔小实蝇促进柑橘类果实中的真菌传播

由于妊娠蝇倾向于在含有青霉菌的柑橘类果实上产卵，我们认为妊娠蝇在柑橘类果实上刺穿产卵器可能会促进真菌的感染。然后，我们比较了三种青霉菌株在完整的柑橘类果实或因机械损伤或产卵感染而受损的果实上的生长情况。结果表明，在接种后第7天观察到，由机械损伤和产卵器引起的损伤显著促进了三株青霉菌的生长(图5a和补充图7a)。然后，我们比较了受损和完整柑橘类果实挥发性有机化合物排放量的变化。在柑橘挥发性有机化合物谱中确定的各种化合物中，α-蒎烯和月桂烯(峰16和19)仅存在于受损果实中，之前的一项研究也表明了这些化合物在刺激真菌生长中的可能作用(图5b和补充表S3)。事实上，与在没有这些化合物的培养皿中培养(在接种后第7天评估干重)相比，向培养皿中添加α-蒎烯和月桂烯(5×10-5)显著促进了青霉菌丝体的生长(图5c、d和补充图7b、c)。

我们还假设，被青霉菌污染的桔小实蝇可能会促进真菌传播。将对照成虫或被青霉菌污染的桔小实蝇引入装有新鲜培养基或完整无菌柑橘的容器中。受污染的果蝇在柑橘上(转移后5天)(图5e)和培养基中(转移后5天)(图5f)导致严重的真菌感染，在未受污染的果蝇和无果蝇的组中，未观察到柑橘果实上青霉菌感染的症状或培养基定植的迹象。此外，我们还发现，从受感染果实上的卵中出现的桔小实蝇可以携带青霉菌孢子到新的柑橘植株中，并在帐篷试验中导致受感染的柑橘果实数量显著增加和真菌生物量增加(图5g)。总体而言，这些结果表明，桔小实蝇的产卵行为可以促进真菌在受损果实中的定植，并且成虫可以作为青霉菌在柑橘果实上传播的潜在载体。

图5 桔小实蝇是该真菌的传播媒介。a 注射器或产卵器造成的伤害对真菌生长的影响。图像显示接种后第7天果实上典型的桔青霉菌病变。柱状条代表接种后第7天桔青霉菌干重的比较(n=3个独立实验，每个实验分析3个样品)。b 产卵器感染、机械损伤或控制完整柑橘果实所释放挥发物的代表性气相色谱痕量。α-蒎烯(c)和月桂烯(d)对真菌菌丝生长的影响(顶部：第1-7天的低倍图像。底部：第7天样品的高倍图像，比例尺：100 μm)。柱状条表示第7天桔青霉菌干重的比较(n=6个独立实验，每个实验分析3个样品)。e、f 受污染的成年桔小实蝇将桔青霉菌分生孢子传播至完整柑橘或无菌培养基的方式。图像分别显示了桔青霉菌感染果实和菌丝在培养基中生长的典型病变。柱状条代表转移后第5天桔青霉菌干重的比较(n=3或6个独立实验，每个实验分析3个样品)。g 帐篷试验。在转移后第7天(n=3个独立实验)记录感染柑橘和对照组(接种水)和桔青霉菌+(接种桔青霉菌)真菌干重。数值是重复的平均值(±SEs)。两组之间的统计比较是基于Students’s t检验。

讨论

本研究展示了一种真菌病原体是如何操纵桔小实蝇的产卵行为以促进其传播的，而作为回报，昆虫的后代获得了营养益处。昆虫和真菌的相互作用始于真菌挥发性有机化合物的释放，以吸引妊娠的桔小实蝇产卵。这种真菌利用产卵器对果实的伤害来进行感染，并提供必需的营养物质(吡哆醇)来支持幼虫的发育。被青霉菌污染的桔小实蝇也可能促进真菌繁殖。 与果蝇的强烈回避和埃及伊蚊对青霉菌的有利吸引相反，我们报告了一种情况，即妊娠的桔小实蝇倾向于在含有青霉菌的部位产卵，而在其他成年阶段避免感染青霉菌的部位。妊娠雌性根据产卵刺激剂或引诱物选择产卵地点。我们从青霉菌中鉴定出挥发性有机物，包括芳樟醇、3-蒈烯和D-柠檬烯，它们是妊娠雌性桔小实蝇的有效产卵引诱剂。此外，与非妊娠雌性桔小实蝇相比，妊娠雌性桔小实蝇中的土臭素反应性Ors表达水平降低。这些结果表明，妊娠雌蝇对土臭素感应的抑制以及青霉菌产生的产卵引诱剂可能有助于妊娠桔小实蝇对接种青霉菌的地点的产卵偏好，这可能是通过综合嗅觉识别介导的。产卵地点确定的特定神经回路需要进一步阐明。 本研究认为，产卵偏好可归因于妊娠诱导的“产前护理行为”，从而为栖息地的后代发育带来健康益处。通常描述的母体行为，如喂养和攻击入侵者，是为了养育和保护新生儿。例如，雌性黑腹果蝇可以根据产卵需要随时开启和关闭对乙酸的吸引力。雌性也倾向于在更好地支持其后代生长的植物物种上产卵，因为昆虫幼虫只能利用有限的资源进行生长和发育。在本研究中，幼虫和蛹肠道中高水平的真菌DNA可以通过食用真菌来解释，因为新孵化的幼虫通常会摄入食物资源或周围环境中存在的各种微生物。因此，发育中的幼虫保持较高水平的B族维生素(吡哆醇)可能来自其微生物伙伴青霉菌，这提高了羽化率并缩短了羽化时间。通过饮食获得B族维生素对昆虫来说至关重要，因为它们缺乏在中枢代谢中合成这些化合物的遗传能力。大多数微生物，包括青霉菌，可以从头合成B族维生素，因此有益于以微生物为食或与微生物相互作用的昆虫。有充分证据表明，共生微生物可以为宿主提供必需的营养素，或改变饮食中特定营养素的可用性。我们的结果还强调了青霉菌在支持桔小实蝇幼虫发育中的有益作用，可能是通过直接合成或通过改变饮食成分产生吡哆醇。 本研究的数据还表明，青霉菌释放的挥发性有机化合物可以调节妊娠雌蝇的产卵偏好，这可能会促进真菌感染，因为休眠的青霉菌孢子可以快速萌发并定植于受伤的果实。受伤柑橘产生的α-蒎烯和月桂烯也能刺激青霉菌的萌发和生长。这些数据支持了妊娠雌蝇的产卵行为有助于柑橘类果实真菌感染的观点。此外，帐篷试验的结果表明，感染果实上出现的桔小实蝇虫卵可作为青霉菌的传播媒介，可能通过附着在受污染桔小实蝇口器或腹部尖端的真菌分生孢子传播。因此，从受感染的果实中出现的桔小实蝇增加了真菌传播的可能性。

综上所述，本研究揭示了青霉菌和桔小实蝇之间有益的相互作用。青霉菌会产生挥发性有机化合物，吸引妊娠的桔小实蝇产卵，这可能会促进真菌在柑橘类果实上的感染和传播。这种真菌通过补充吡哆醇来奖励发育中的幼虫，以增强其羽化能力。这种相互作用对双方都有好处，并稳定了真菌与昆虫的共生关系。重要的是，我们的发现还解决了为什么清理腐烂和受损果实可以减轻产量损失的难题，因为受损果实的存在促进了这些害虫和病原体的相互作用和传播。