科研丨J CROHNS COLITIS: 儿童克罗恩病的成功饮食治疗与细菌生态失调和炎症代谢型向健康对照的转变有关

编译：微科盟溧阳，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

克罗恩病排除饮食+部分肠内营养(CDED+PEN)或完全肠内营养(EEN)的治疗可缓解轻度至中度儿童克罗恩病(CD)并减少炎症反应。本研究旨在评估营养治疗是否可以通过调节菌群组成和功能失调从而得到缓解。评估了54例营养治疗(CDED+PEN或EEN)后儿童CD患者得到缓解的粪便宏基因组序列、短链脂肪酸(SCFA)和胆汁酸(BA)，并与26例健康儿童进行了比较。饮食疗法降低CD患儿变形菌门的相对丰度，增加了厚壁菌门的丰度。CD患儿有M1和M2两种代谢型，而健康儿童仅有M1代谢型。M1的特征为拟杆菌门和厚壁菌门丰度增加、变形菌门丰度减少、短链脂肪酸合成途径增加，而M2的特征为变形菌门丰度增加、SCFA降解相关基因富集。M1占比在饮食治疗期间增加：46%、63%和74%(分别在第0周、6周、12周)。12周后，变形菌门的菌属(除E. coli外)恢复至健康对照水平。尽管SCFA合成途径增加，但症状缓解效果与SCFAs增加无关。初级BA在CDED+PEN组没有变化，但在EEN组降低。综上所述，饮食疗法成功地调节了菌群组成和功能失调。然而，12周的饮食不足以完全恢复失调。我们的数据表明菌群组成和代谢型很重要，并在饮食干预的早期临床反应中迅速变化。因此，纠正生态失调可能是未来CD治疗的重要目标。  

论文ID

原名：Successful Dietary Therapy in Paediatric Crohn’s Disease is Associated with Shifts in Bacterial Dysbiosis and Inflammatory Metabotype Towards Healthy Controls

译名：儿童克罗恩病的成功饮食治疗与细菌生态失调和炎症代谢型向健康对照的转变有关

期刊：Journal of Crohn's and Colitis

IF：10.02

发表时间：2022.9

通讯作者：Johan E. Van Limbergen

通讯作者单位：荷兰阿姆斯特丹大学医学中心艾玛儿童医院

DOI号：10.1093/ecco-jcc/jjac105

实验设计

结果

从74名患者中的54名患者获得了完整的宏基因组序列(临床缓解)，41名参与者在三个时间点均得到可用数据(CDED+PEN：n=23，EEN：n=18)。由于样本可用性，我们分析了53例患者(151个样本)的SCFA数据和42例患者(93个样本)的BAs数据。两组在年龄、性别、疾病部位、病程、疾病活动度、C-反应蛋白(CRP)或药物使用方面的基线特征无统计学差异。

1 微生物组随着饮食引起的缓解而改变

1.1 0-6周:变形菌减少

根据宏基因组的分类学数据，基于Bray-Curtis距离的差异性检验显示，在基线和第12周之间两种饮食方式使得患者菌群组成向健康组转变(Permanova p=0.001；图1)。通过LEfSe分析更详细地识别了这些菌群变化，确定了处理组和健康对照组之间的差异菌群。与健康组相比，基线期CD患儿肠道中变形菌门，特别是Escherichia、Burkholderiales和Klebsiella；梭杆菌门中的Akkermansia和Bifidobacterium以及厚壁菌门中的Streptococcus、Veillonella、Holdemania、Peptostreptococcaceae和Blautia丰度较高。此外，Saccharomyces、Bacteroidales、Alistipes和Parabacteroides以及Firmicutes、Eubacterium、Anaerostipes、Lachnospiraceae、Roseburia、Oscillibacter、Anaerotruncus、Clostridaceae和Ruminoccocus丰度较低(图2)。

图1 Bray-Curtis距离的β多样性图显示，与健康对照组相比(n=26)，采用EEN [n = 22、20、14、6]和CDED+PEN [n = 30、28、25、1]的患者在第6周获得缓解。EEN：完全肠内营养；CDED+PEN：克罗恩病排除饮食+部分肠内营养。

图2 分类群LEfSe分支图显示，与健康对照组(HC, n=26)相比，基线(第0周)CD儿童(CDED+PEN和EEN组，n=52)的肠道菌群丰度存在显著差异(p<0.05)。分析仅包括第6周达到缓解的患者的样本。每个点代表该数据中已识别的分类群。与HC相比，红色表示第0周CD样本中增加的分类群，绿色表示减少的分类群。

与基线相比，在第6周使用两种饮食疗法得到临床缓解的CD患者肠道中厚壁菌门，特别是Clostridiales丰度显著增加，由 Roseburia、Oscillibacter、Anaerotruncus和Ruminococcus驱动，而变形菌门(尤其是γ变形菌)丰度显著减少(p<0.05)。与健康样本相比，两组患儿的变形菌门相对丰度增加(Escherichia、Klebsiella、Citrobacter、Burkholderiales和Agrobacterium)，而Firmicutes-like bacilli(Lactococcus和Streptococcus)和Clostridia(Roseburia、Eubacterium和Ruminococcus)仍在健康样本中占主导(图3a)。

EEN患儿肠道中属于厚壁菌门类群的Clostridiales、Erysipelotrichaceae和Veillonellaceae丰度显著增加(p<0.05)，而变形菌门丰度下降。与健康对照样本相比，EEN饮食样本菌群组成在第6周时有所不同：厚壁菌门丰度整体减少(特别是Lachnospiraceae、Peptostreptococcus、Blautia、Subdoligranulum、Veillonella和Gemella)，一些特定的类群(Dialister、Ruminococcus、Roseburia、Coprococcus、Eubacterium、Lactococcus和Streptococcus)丰度则有所增加。与健康对照相比，在EEN饮食6周后，变形菌门(Klebsiella、Escherichia、Enterobacter、Citrobacter和Parasuterella)的丰度仍然增加(图3b)。

总体而言，从第0周到第6周，两种饮食疗法都显著减少了变形菌门丰度，增加了厚壁菌门丰度。尽管在第6周通过饮食治疗达到临床缓解时变形菌门的丰度下降，但与健康对照组相比仍有所增加(图3，4)。与健康对照相比，基线期患者肠道中E. coli相对丰度尤其引人注目(Wilcoxon BH校正，p=0.0005；图4)。

由于分析是基于成分数据，对其它类群增加和/或减少可能比较敏感，我们通过对数比来检验与协变量相关的差异丰度，并通过Qurro进行可视化。以Bacteroidetes作为参考组，因为它在样本和时间点之间最一致。第6周时，CDED+PEN饮食患儿肠道中厚壁菌门总体上没有显著增加(p>0.05)。然而，变形菌门丰度在前6周内显著下降(p=0.02)，主要由γ-变形菌(0周vs 6周，p=0.073)驱动，即来自Escherichia属。有趣的是，在前6周，EEN饮食患儿肠道中厚壁菌门和变形菌门的丰度变化并不明显(p>0.05)。在门水平上的ALDEx2成分分析发现，在第0周和第6周，变形菌门丰度在两种饮食疗法与健康对照组之间有显著差异。

图3 分类群LEfSe分支图显示，在第6周时，不同饮食组临床缓解样本与健康对照组(HC，n=26)存在显著差异(p<0.05)。每个点代表这些数据中已识别的分类群。与HC相比，红色表示第6周CD样本中增加的分类群，绿色表示减少的分类群。(A)第6周CDED+PEN(n=28) vs HC(n=26)；(B)第6周EEN组(n=20) vs HC(n=26)。

图4 与健康对照组相比，CDED+PEN和EEN饮食的儿童在不同时间点上所选变形菌的相对丰度变化。EEN，完全肠内营养；CDED+PEN，克罗恩病排除饮食+部分肠内营养。

1.2 第6-12周:变形菌进一步减少

在第6周和第12周之间继续使用CDED+PEN饮食治疗使得变形菌门丰度进一步减少，并接近健康对照组。然而，在CD患者肠道中Proteobacteria属Escherichia和Sutterella含量仍然比较丰富，并与健康样本存在显著差异(Wilcoxon p<0.05，LDA>2；图4)。值得注意的是，与其它Proteobacteria属相比，炎症状态下基线期Escherichia的相对丰度要高得多(图4)。在增加的厚壁菌门中，患者肠道中Faecalibacterium和Blautia含量增加，但仍与健康对照组有显著差异。在第12周时，与CDED+PEN饮食相比，健康组样本中的Anaerostipes、Ruminococcus、bacilli、Porphyromonadaceae、Bifidobacteriales、Ascomycota和Caudovirales的丰度更高。

在EEN饮食后的第6周和第12周之间逐渐恢复正常饮食导致变形菌门(即Enterobacter)丰度增加，并与健康对照组有明显差异。厚壁菌门中的Streptococcus、Blautia和Faecalibacterium的丰度随着恢复正常饮食而增加，而Peptostreptococacceae、Eubacterium、Anaerostipes、Coprococcus和Ruminococcus仍然在健康对照组中比较丰富。

对CDED+PEN组样本进行Songbird成分分析，再次发现除Oscillospiraceae外(0周vs 12周，p=0.03)，厚壁菌门丰度没有发生显著变化(6周 vs 12周，0周 vs 12周)，在门水平上，变形菌门丰度在第6周和第12周时持续减少，并与基线相比显著下降(6周 vs 12周，p=0.16；0周 vs 12周，p<0.01)。这一结果主要由Escherichia-γ变形菌丰度下降导致(p<0.01)。在该分析的所有时间点，EEN饮食引起菌群丰度变化均不显著( p>0.05)。门水平的ALDEx2分析发现，EEN样本中变形菌丰度在第12周时与健康对照组相比存在显著差异。然而，第12周时CDED+PEN样本与健康对照组间没有显著差异。

2 微生物组代谢型

为了超越单独的酶/代谢物的关联研究，我们使用无监督贝叶斯群落代谢分析方法(BiomeNet)来确定与健康、疾病和实现缓解相关的微生物代谢型。在无监督分析中，将健康对照组与所有CD患者进行比较，发现患者样本分为两种代谢类型(M1和M2)。所有健康对照组均以后验概率(PP)>0.9归类于代谢型M1。CD患者同时具有M1和M2两种代谢型，其混合类型与治疗阶段有关。随着饮食治疗进行，得到临床缓解CD患者的M1比例不断增加，从治疗前的48%增加到第6周的63%和第12周的74%，并且混合权重的变化是显著的[配对Wilcoxon检验；基线 vs 第6周(p=0.03)；基线vs第12周(p<0.01)；第6周 vs 第12周(p<0.01)]。

19个主要的反应亚网络对M1和M2有不同的影响。在代谢型确定的通路中，有1个反应子网络在两种代谢型之间存在显著差异，涉及多种糖代谢的反应，特别是被磷酸转移酶修饰的反应。

基于Bray-Curtis距离比较样本的宏基因组多样性发现代谢型在不同时间点也存在显著差异(Permanova，p<0.01)。参与M1的主要分类群有Prevotella copri、Bacteroides cacceae、Alistipes putredinis、Faecalibacterium praustnitzii、Bacteroides stercoris和Bacteroides uniformis。参与M2的主要分类群有Bacteroides ovatus、Ruminococcus torques、Akkermansia muciniphila、Escherichia coli、Clostridium bolteae、Veillonella parvla和Enterococcus faecalis。为了更深入地了解代谢型中的微生物结构，使用BioMiCo分析了16S rRNA基因数据，确定了四种主要微生物组合(PP>0.1)，两种定义M1和两种定义M2，以及八种次要微生物组合(0.1>PP>0.05)，五种定义M1和三种定义M2。M2代谢型与高丰度Proteobacteria相关(M1蓝色，图5；M2红色，图6)。BioMiCo分析确定的代谢型主要贡献类群与Permanova分析中最大系数的代谢型分类群相似。此外，使用主题模型(NMF和STM)确定的菌群结构与BioMiCo分析结果几乎相同。

图5 M1代谢型群落结构。

利用16S rRNA基因数据中鉴定的分类群，对M1代谢型样本通过BioMiCo分析鉴定的群落结构进行Cytoscape可视化。节点代表分析中识别的优势分类群，其大小表示这些分类群在组合中的贡献的总后验概率。边表示在一个组合中同时出现的分类群。

图6 M2代谢型群落结构。

利用16S rRNA基因数据中识别的分类群，对M2代谢型样本通过BioMiCo分析鉴定的群落结构进行Cytoscape可视化。节点代表分析中识别的优势分类群，其大小表示这些分类群在组合中的贡献的总后验概率。边表示在一个组合中同时出现的分类群。

3 短链脂肪酸

在第0周时，CDED+PEN和EEN组之间的SCFAs没有显著差异。粪便SCFA浓度在CDED+PEN组的三个时间点没有显著变化(p>0.05)。与基线相比，EEN饮食达到缓解的患者肠道中总SCFA浓度以及乙酸、丙酸和丁酸含量在第6周显著下降(Welch's t检验分别为p<0.01，p<0.01，p=0.02，p<0.01)，摄入其他食物后，在第6周和第12周相比其含量增加(分别为p=0.01，p=0.02，p=0.11，p<0.01)。在第6周得到缓解的CDED+PEN组和EEN组的总SCFA、乙酸、丙酸和丁酸存在显著差异(p<0.01，p<0.01，p=0.02，p<0.01)，但这些差异在第12周时消失。

SCFA浓度也与患者的M1、M2代谢型相关。M1与较高浓度的丁酸(p=0.02)和戊酸(p<0.001)相关。参与丁酸合成的基因也与M1和M2相关。以90% PP为临界值发现，M1中显著增加的基因包括丁酸激酶(K009290)、磷酸丁酰转移酶(K00634)、4-羟基丁酰基-CoA脱水酶(K14534)和β-赖氨酸5,6-氨基变位酶(K01844)显著减少的基因包括L-谷氨酸降解为丁酸和烯酰基-CoA水合酶的基因(K00134、K01035、K08318、K01029、K01615、K01039、K01040、K01825、K01782、K01692、K01715)。

4 胆汁酸

在基线时，CDED+PEN和EEN组样品中的共轭或非共轭初级胆汁酸、次级胆汁酸和总胆汁酸水平没有显著差异。在EEN和CDED+PE组的所有时间点，总胆汁酸水平保持稳定。第6周时EEN组初级胆汁酸水平显著下降(p=0.04)，但在第12周时没有持续下降(p=0.095)。CDED+PEN组在所有时间点上初级胆汁酸水平没有变化。EEN组在第6周时各时间点主要的次级胆汁酸水平没有显著增加(p=0.06)，而在两种饮食治疗下，总次级胆汁酸水平在所有不同时间点均保持稳定。

讨论

本研究证明了饮食诱导的症状缓解与恢复菌群失衡、调节菌群组成和代谢途径向健康对照转变有关，这在CDED+PEN饮食中尤为显著。然而，6周的饮食还不足以完全恢复肠道微生物使其达到与健康对照组相当的水平。先前的研究发现，通过16S rRNA扩增子数据分析门水平菌群组成发现，第6周到12周，CDED+PEN饮食改变了患者肠道微生物组成。EEN组患者肠道微生物在第12周时回到治疗前的失调状态，尽管同时使用相似剂量的PEN进行治疗，但习惯性饮食会伴随炎症的反弹。在本研究中，通过宏基因组分析发现食疗降低了变形菌门的丰度，增加了厚壁菌门和拟杆菌的丰度，并诱导代谢型逐渐向健康对照组转变。另一方面，饮食诱导的症状缓解与SCFA或BA的浓度变化无关。本研究结果为肠道微生物组成、功能和代谢在饮食诱导CD症状缓解中的作用提供了更多见解。

在属水平上寻找EEN和CDED+PEN诱导缓解的共同点可能有助于了解菌群中哪些变化驱动了对失调的响应和纠正，即“re-biosis”。发现在不同饮食诱导下症状缓解共同点来自变形菌门的属，其丰度下降。在治疗前的炎症状态下，Escherichia、Haemophilus和Citrobacter丰度较高，在饮食干预后下降至健康对照组水平。这可能是由于饮食的直接影响(低脂肪、低血红素、EEN和CDED+PEN中的简单碳水化合物)以及炎症减少的间接影响。在不同治疗策略中，厚壁菌门丰度的增加并不一致，因为不同菌属的增加或减少更多地取决于患者所遵循的饮食而不是总体反应。临床症状的改善(如，胃肠道转运时间、肠道炎症减少和氧气可用性)也会引起肠道微生物的改变，尽管分析结果根据所使用的方法而异，但使用包括成分分析在内的各种方法结果表明，饮食诱导的临床缓解与变形菌丰度减少相关。在具有大量稀疏数据集的生态失调群落中，校正微生物组的组成性质尤其具有挑战性。我们的结果表明，变形菌丰度的下降可能在饮食治疗实现临床缓解方面发挥重要作用，尤其是CDED+PEN疗法。厚壁菌门丰度的增加可能部分由于二次生态位扩张，部分是因为两种饮食的底物不同。在EEN饮食中观察到厚壁菌门丰度增加，也支持了二次生态位扩张的可能性，缺乏纤维通常会使厚壁菌门丰度增加。

先前的一项研究比较了在CD患者和健康对照组之间菌群失调中EEN、高热量摄入PEN和抗肿瘤坏死因子(TNF)，证明了自由饮食下的PEN(使用EEN配方的50%-90%)使得菌群组成远离健康对照组。在这里，我们发现CDED+PEN与菌群失调的逐渐恢复和相关的代谢物途径向健康对照组转变相关，这有助于持续缓解轻度至中度CD儿童症状。接受CDED+PEN饮食诱导治疗患者在进入症状缓解期时，其代谢型逐渐向健康儿童的M1代谢型转变。这种代谢型主要是以Bacteroidetes和Firmicutes组成为特征。有趣的是，CDED是一种低脂饮食，强制摄入水果和抗性淀粉。低脂饮食会增加肠道中Bacteroidetes丰度，减少Firmicutes丰度，但在高丰度的Proteobacteria状态下，低脂肪/高纤维组合可能有利于通过减少Proteobacteria以及增加Bacteroidetes和Firmicutes丰度来恢复菌群失调。这一结果表明，CD中的菌群失调也具有功能性。然而，这些菌群组成和功能向健康微生物组“状态”转变需要的时间可能比达到临床缓解所需时间更长，因为大多数在第6周达到临床缓解的患者在第3周已经处于缓解或临床反应阶段，而代谢型在12周内持续发生变化，但仍未达到100%M1代谢型。达到“正常生态”(即在健康宿主中发现的微生物组模式)，并通过饮食疗法维持更长时间的健康代谢型可以延长临床缓解时间，避免回到基线特征。

从基线到第6周和第12周的代谢型逐渐改善表明，在功能水平上，以微生物组为重点的治疗可能需要更持久的干预。我们发现M2(在活动性疾病中占主导地位)与较低水平的SCFA和磷酸转移酶相关的途径相关，磷酸转移酶具有广泛的调节作用，包括生物膜形成和毒力，并参与许多不同的复杂糖代谢。对宏基因组数据结合各种贝叶斯分析表明，在较高M2状态下，较低水平的SCFAs可能是由于生成减少(丙酮酸产生的SCFA)以及消耗增加(与疾病相关的菌群消耗更多的SCFA和使用替代丁酸产生途径)。SCFA合成能力增加和丁酸水平升高已被证明可作为更稳定、与健康相关的代谢型的标志物，最近表明这对维持anti-TNF和硫唑嘌呤缓解很重要。然而，SCFA浓度(仅反映少量的总肠道SCFA代谢)与EEN或CDED+PEN临床缓解无关。

胆汁酸(BA)可以调节肠道免疫反应，其组成可随肠道菌群的变化而变化。我们之前已经证明保持解偶联完整性(通过胆盐水解酶)，并且降低脱羟基能力导致初级胆汁酸向次级胆汁酸转化受损，造成CD生态失调中初级胆汁酸高/次级胆汁酸低。本研究表明EEN造成初级胆汁酸减少，并且当仅关注LCA+DCA时，次级胆汁酸水平相应增加，而这在CDED+PEN组中没有出现。EEN出现的胆汁酸变化似乎更多地受到饮食诱导的直接影响。总之，SCFA和BA数据表明，这些代谢物并不是整个饮食干预早期临床反应的主要驱动因素。

本研究提出了一个有趣的概念，即微生物组可能成为CD的治疗靶点。我们将“re-biosis”表示为对治疗的反应以及在饮食治疗过程中伴随的与健康对照一致的微生物组代谢特征变化。因此，“re-biosis”的功能和分类可能成为更广泛的生物标志物，显示出疾病期间肠道“健康”的整体视角。

本研究存在几个局限性。首先我们没有研究黏膜细菌，因为这需要在12周后进行完整的结肠镜检查，目前针对儿童CD治疗中还不需要这种检查。其次我们分析的本质是宏基因组，虽然仅检测了SCFA和BA浓度，然而本研究的宏基因组通路和代谢组最终产物的检测是在“具有统一治疗方法和效果的患者”的严格定义中同时进行，目前对这方面的研究很少。并且我们的数据不是横断面的，大多数患者在基线时没有服用任何药物，因为药物也会引起微生物组的变化。最后由于粪便样本量有限，样本无法用于所有时间点和所有获得宏基因组测序数据患者的BA分析。宏基因组测序研究的一个常见限制性是微生物组变化的相对丰度问题，我们通过结合各种分析方法来解决这个问题。在本研究中使用先前发表的健康人群数据作为对照，这些数据是在不同的机构进行测序的。然而，将CD患者与这些健康对照进行比较时，我们的结果清楚地表明，研究随着时间的推移发生生物学变化，而不是由测序方法的差异引起，因为健康对照明显具有M1代谢型，而CD患者具有M1+M2混合代谢型，并且M1的比例随着所有样本在第6周达到临床缓解而逐渐增加。最后，尽管数据表明变形菌丰度的减少是与饮食诱导的临床缓解相关的主要途径，但不可能从6周的时间间隔中明确哪个分类群随着临床缓解首先发生变化，因为一个分类群的减少往往导致另一个分类群的增加。

此处提供的数据证实了我们之前的报道，持续CDED+PEN饮食疗法超过6周可避免疾病相关物种的“反弹”，尤其是变形菌，而厚壁菌门丰度在恢复正常饮食时也没有下降。在之前的研究中，我们证明了EEN饮食后，粪便钙卫蛋白的增加与恢复习惯性饮食有关，在一个独立的苏格兰队列中也报告了这一点。这些研究表明，即使已经达到临床缓解，也需要更长时间的持续饮食治疗(>12周)才能巩固与饮食变化相关的早期微生物组变化。由于CDED+PEN比单调的EEN更容易使人接受，因此CDED+PEN疗法在日常实践中是可行的。

结论

综上所述，从组成和功能的角度来看，似乎可以通过饮食疗法来恢复微生物失调。十二周的饮食治疗使肠道微生物组成更接近健康对照组的状态，但这一时间似乎不足以完全实现“re-biosis”。虽然M1(“健康”)代谢型随时间而增加，并与SCFA浓度的增加相关，但12周内，粪便SCFA没有增加，也与临床症状缓解无关。这种有益的产生SCFA的菌群对临床缓解的贡献似乎并不像减少的变形菌那样重要。这表明减少“病原体”要么是在恢复过程中的早期阶段，要么减少炎症比恢复有益菌群来预防炎症更为重要。事实上，由于微环境的变化，变形菌的减少可能使有益菌群的增加成为可能。因此，其它代谢过程(特别是变形菌)可能有助于实现临床缓解和相关的微生物菌群和功能转变。通过有益的分类群恢复微生物组和代谢组来维持这种状态，以防止炎症复发或在未来实现治愈。随着微生物群失衡作为肠道炎症诱因的作用变得更加清晰，调节菌群失调可能成为未来重要的临床治疗目标，从而引入针对微生物组和炎症的治疗策略来改变疾病的进展或复发。

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