马梦诗：一种基于2-[18F]FDG和抗PD-L1抗体联合的

2022年12月22日，由中国医师协会核医学医师分会青年委员会举办的【文献导读】（第18期）活动圆满完成。本次导读活动由南方医科大学南方医院和吉林大学中日联谊医院共同承办，通过腾讯会议的方式在线上开展，南方医科大学南方医院核医学科李洪生教授和吉林大学中日联谊医院核医学科柏林教授共同主持了本次活动。南方医科大学南方医院核医学科吴湖炳教授及北京化工大学化学学院宋继彬教授莅临指导，并进行了精彩点评。中国医师协会核医学医师分会多名青年委员、核医学领域多名学者及研究生、规培生等百余人参与了线上交流与讨论。在第二篇文献导读中，吉林大学中日联谊医院核医学科博士研究生马梦诗分享了《一种基于2-[18F]FDG和抗PD-L1抗体联合的癌症免疫治疗新范式》的基础研究文献。该文献是2022年3月发表在Clinical Cancer Research(IF=12.531)上，原文标题《A Paradigm of Cancer Immunotherapy Based on 2-[18F]FDG and Anti–PD-L1 mAb Combination to Enhance the Antitumor Effect》，该研究主要探索2-[18F]FDG可以诱导PD-L1表达变化并为肿瘤免疫治疗创造有利于免疫的微环境。

研究背景：

免疫治疗的巨大成功开启了癌症治疗的一个新阶段，免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗疗法，主要包括免疫检查点抑制剂（ICB）、过继性细胞转移疗法（ACT）、肿瘤特异性疫苗、小分子免疫药物等。免疫检查点抑制剂是肿瘤免疫治疗的主要研究方向，其中最具代表性的是PD-1/PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂。临床研究结果显示，ICB疗法的实际获益人群占患者比例极小。在临床上我们会针对非小细胞肺癌（NSCLC）患者PD-L1表达水平来决定是否应用免疫治疗，所以肿瘤PD-L1的表达被认为是一种预测性的生物标志物，可以筛选可能从PD-1/PD-L1免疫治疗中获益最大的人群。

我们已知低剂量辐射可通过激活IFNγ、TNFα等炎性细胞因子信号转导，重塑肿瘤微环境(TME)，促进抗肿瘤免疫细胞增殖。电离辐射(IR)后，癌细胞的PD-L1表达瞬间上调，当PD-1/PD-L1相互作用在上调过程中被抗PD-1抗体阻断时，在免疫能力强的小鼠肿瘤模型中，t细胞活性恢复，肿瘤生长延迟。然而，对于大多数转移性癌症患者来说，使用外束放疗对所有肿瘤进行低剂量的免疫调节辐射是不现实的，因为对隐匿部位的靶向性较差，而且大范围或全体放疗具有明显的毒性。放射性核素治疗后的免疫调节仍是一个新的研究领域，将靶向放射性核素治疗与免疫治疗相结合，提高特异性靶向性，提高转移癌的治疗效果。

为什么是18F而不是我们熟知的治疗性核素，比如177Lu、90Y或者131I呢？低水平的DNA损伤可导致细胞周期阻滞并促进DNA损伤修复，而严重的DNA损伤可导致细胞凋亡，我们希望肿瘤细胞的DNA受到一些损伤，修复之后可以发生一些变化，再应用免疫治疗去消灭肿瘤细胞，不是要直接的破坏肿瘤细胞。所以我们考虑这种诊断性的放射性核素。2-[18F]FDG作为临床应用最广泛的PET示踪剂，全球每年有数千万例的肿瘤患者需要用到2-[18F]FDG的PET显像进行辅助诊断。基于核素特性的考虑，如果18F基PET示踪剂能够应用于核素治疗，将会扩大传统的肿瘤治疗模式。

技术路线：

本篇文献主要分为体内实验和体外实验。利用流式细胞术、免疫荧光、RT-qPCR体外验证PD-L1表达水平经2-[18F]FDG刺激后明显上调。利用普通转录组测序、细胞克隆形成、Western blot、免疫荧光体外实验探索2-[18F]FDG与PD-L1上调的内在关联。利用PET成像、免疫组化、流式细胞术体内外验证2-[18F]FDG是否能增加anti-PD-L1抗体的摄取。利用ELISA、流式细胞术体内实验观察2-[18F]FDG与anti-PD-L1抗体联合治疗是否能增强抗PD-L1免疫治疗的疗效。

研究结果：

1. 经2-[18F]FDG刺激，肿瘤表面PD-L1表达上调

首先，通过流式细胞术、免疫荧光和RT-qPCR分别在多个肿瘤细胞系CT26（结直肠癌细胞系）、MC38（结直肠癌细胞系）、4T1（乳腺癌细胞系）和B16F10（黑色素瘤细胞系）中验证2-[18F]FDG诱导PD-L1上调。在与2-[18F]FDG共孵育24h后，CT26、MC38、4T1和B16F10肿瘤细胞中PD-L1阳性细胞的比例显著增加，分别为由23.3%增加到96.5%、54.3%增加到98.7%、21.8%增加到60.6%、61.4%增加到96.2%（图1A，B）。同样地，免疫荧光实验也证实了肿瘤细胞的PD-L1表达上调（图1C，D）。RT-qPCR结果显示MC38和CT26细胞上的PD-L1 mRNA表达增加（图1E）。此外，研究还发现PD-L1 表达在 2-[18F]FDG 诱导后呈剂量依赖性上调（图1F）。为了探索2-[18F]FDG诱导PD-L1表达上调的机制，利用转录组学揭示了多个与PD-L1相关基因的上调以及一些可能的信号通路改变，如NOD样受体信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等（图1G，H）。

通过细胞克隆形成实验观察2-[18F]FDG对细胞活力的影响，发现即使是较高剂量的2-[18F]FDG，也不会造成大多数肿瘤细胞死亡（图2A）。而这一现象猜测是由于DNA损伤修复引起的。免疫荧光检测DNA损伤程度及修复水平，相较于对照组，用2-[18F]FDG处理过的实验组存在明显的DNA损伤及损伤后修复的过程发生（图2B）。进一步通过western blot确认2-[18F]FDG诱导PD-L1上调的影响因素，证明了NF-κB和IRF3信号通路的激活，并且验证了DNA损伤后修复的过程可以通过激活NF-κB和 IRF3信号进而上调PD-L1的表达（图2C，D）。此外，DNA损伤后PD-L1的上调也通过STAT1/3-IRF1通路介导。

鉴于2-[18F]FDG可以造成肿瘤细胞表面PD-L1表达的改变，随后又通过PET成像技术进行体外验证（在小鼠皮下瘤模型中），结果显示肿瘤区域的信号强于其他组织的信号，且2-[18F]FDG在肿瘤病灶中累积（图4A，B）。免疫组化结果表明，在24小时内，与对照组相比，摄取2-[18F]FDG的肿瘤区域的PD-L1表达水平呈强阳性（图4C，D）。在含有2-[18F]FDG放射性示踪剂的组中，通过流式细胞术检测肿瘤PD-L1的表达，其从第1天到第7天呈下降趋势（图4E，F）。构建NSCLC PDX肿瘤模型，分为高和低2-[18F]FDG摄取组（PDXH-FDG vs PDXL-FDG）。流式细胞术分析显示，PDXL-FDG组中PD-L1的表达变化（24.9±3.5%）低于PDXH-FDG组中PD-L1的表达变化（76.9±4.9%）（图4I，J）。与流式细胞术结果一致，免疫组化结果显示PD-L1在PDXH-FDG组中表达更显著（图4K）。

为了进一步探索2-[18F]FDG对增强免疫治疗的免疫调节作用，随后研究了αPD-L1单抗与2-[18F]FDG协同作用对MC38肿瘤生长延迟的影响。结果表明，在合适的剂量（18.5 MBq 2-[18F]FDG或37 MBq 2-[18F]FDG + 400 μg αPD-L1 mAb ）和4小时时间窗的条件下，治疗效果最佳（图5A-C）。ELISA检测小鼠血清中的免疫刺激细胞因子水平。2-[18F]FDG + αPD-L1单抗的联合组增加了IFN-γ、TNF-α和IL-6的产生，且比单一治疗或生理盐水组维持更长的时间，这可能解释了协同抗癌的功效（图5D）。通过流式细胞术检测分析脾脏中效应记忆T（TEM）细胞（CD8+CD44highCD62Llow和CD4+CD44highCD62Llow）的浸润情况以验证联合治疗产生的免疫记忆（图5E，F），在37 MBq 2-[18F]FDG + 400μg αPD-L1@4h组中，脾脏TEM细胞的水平在第3天和第7天之间逐渐增加，且在60天内，TEM细胞一直维持在高水平。此外，在第91天再次接种MC38肿瘤细胞，未观察到肿瘤复发（图5G，H）。这些结果证明了该联合治疗策略不仅有强大的抗肿瘤效果，且可以产生免疫记忆，防止肿瘤的复发。

2-[18F]FDG对PD-L1 ICB的影响是多方面的。流式细胞术结果显示，2-[18F]FDG + αPD-L1单抗@4h的组合显著增加了CD4+Th1和CD8+CTL的数量（图6A，B）。在接受2-[18F]FDG + αPD-L1单克隆抗体治疗的MC38小鼠中，肿瘤浸润性CD45+CD8+IFN-γ T淋巴细胞和CD45+CD4+IFN-γ T淋巴细胞的数量约为生理盐水组的5倍（图6C，D）。然而，肿瘤中免疫抑制性CD45+CD4+FOXP3+调节性T细胞（Treg）的占比更少（图6E，F）。进一步对比分析显示，联合用药组的CD4+ Teff/Treg和CD8+ CTLs/Treg比率显著增加（图6C，D）。除T细胞外，免疫细胞的其他改变也很显著。通过流式细胞术检测M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、树突状细胞（DC）和髓源性抑制细胞（MDSC）（图6G-J）。接受37Mbq 2-[18F]FDG + 400μg αPD-L1@4h联合治疗的MC38荷瘤小鼠，M2巨噬细胞占比减少，M1巨噬细胞占比显著增加，这表明免疫抑制减少，抗肿瘤免疫增强（图6K）。同样地，联合用药组激活的DC（CD80+CD86+）比生理盐水组增加2.5倍（图6I，L），MDSC（CD45+CD11b+Gr-1+）的比例比生理盐水组或2-[18F]FDG单一治疗组减少约10倍，这表明免疫抑制微环境得到缓解（图6J，L）。

研究结论：

该研究将核医学成像示踪剂2-[18F]FDG作为免疫调节剂来增强anti-PD-L1抗体免疫治疗并取得出乎意料的效果，为诊断型核素与免疫治疗的联合应用提供了一种新的范式。

展望：

距离应用于临床还有多远的距离？

在FDA基于体表面积剂量正常化的经验方法指导下，925 MBq/kg 2-[18F]FDG应用于小鼠MC38肿瘤模型，人体当量剂量为75.2 MBq/kg。体重60公斤的成年人，大约需要4.4 GBq 2-[18F]FDG。有文献报道静脉给药2-[18F]FDG后全身平均吸收剂量为0.0103 mSv/MBq。给药4.4 GBq 2-[18F]FDG后，全身平均吸收剂量为45.7 mSv。根据美国国家研究委员会的建议，当短期辐射摄入量低于100 mSv时，几乎不会对人体健康造成任何风险。因此，我们的给药策略的剂量耐受性良好。由于药物在人与小鼠药代动力学上的差异，αPD-L1单抗在体内的半衰期和消除率不同，在此范式能够直接转化到人体内之前，还需要探索更多的给药剂量和时间窗实验。

专家点评：

宋继彬教授：这篇文章非常有新意，同时对18F-FDG分子探针的设计、性能、表征的检测以及体内、体外实验研究也非常完整，最重要的是对后续研究提供了非常好的思路。靶向PD-L1的核素分子探针应该具有分子量小、亲和力高等特点，临床应用前景非常广阔，可以实现无创的、实时的、可重复的监测免疫治疗过程中PD-L1的表达水平，重塑肿瘤微环境，具有极大的临床转化应用价值。李囡教授：本篇文章选题新颖、内容丰富、准备充分、组织有序，核医学科应用最广泛的放射性核素18F-FDG居然可以上调PD-L1的表达水平，陈小元教授能够有如此新颖的想法，并且身体力行将想法付诸实践，这对广大青年医生有很大的启示作用。

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