作者解读丨内蒙古农大: 益生菌Probio-M9驱动小鼠乳腺肿瘤抑制作用与宿主肠道菌群及血清代谢物相关(国人佳作)

编译：九卿臣，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

肠道菌群可能影响肿瘤生长和肿瘤治疗效果，是肿瘤防治的潜在靶点。本研究调查了一种益生菌菌株，鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9 (Probio-M9)对小鼠乳腺癌的预防和治疗作用。36只雌性小鼠随机分为三组(每组12只)：对照组(无肿瘤移植)、模型组(肿瘤移植；无益生菌)和益生菌组(口服30天，肿瘤移植前7天开始)。记录肿瘤大小的变化，并在试验结束时收集血液、肿瘤组织和粪便样本进行分析。与模型组相比，益生菌组肿瘤体积明显减小(p<0.05)，粪便菌群Shannon多样性指数较高，肠道菌群结构发生显著改变(p<0.05)，以Alistipes sp._2、Porphyromonadaceae bacterium_7和Bacteroidales bacterium 55_9较多(p<0.05)，此外，Probio-M9可提高血清IFN-γ、IL-9、IL-13、IL-27水平和几种代谢物(如吡哆醛、烟酸、3-羟基丁酸、谷氨酰胺；p<0.05)，同时降低IL-5(p<0.05)。这些变化可能与Probio-M9对乳腺肿瘤生长的保护作用有关。因此，使用益生菌可以利用宿主肠道微生物组进行抗癌反应。  

论文ID

原名：Lacticaseibacillus rhamnosusProbio-M9-Driven Mouse Mammary Tumor-Inhibitory Effect is Accompanied by Modulation of Host Gut Microbiota, Immunity, and Serum Metabolome

译名：鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9驱动小鼠乳腺肿瘤抑制作用伴随着宿主肠道菌群、免疫和血清代谢组的调节

期刊：Nutrients

IF：6.706

发表时间：2022.12.20

通讯作者：郭丽茹

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号：10.3390/nu15010005

实验设计

36只小鼠饲养在动物环境中驯化一周，并随机分为3组，每组12只(图2a)，包括：(1)对照组(无肿瘤异种移植或益生菌干预)；(2)模型组(异种肿瘤移植但不进行益生菌干预)；(3)益生菌组(移植肿瘤加灌胃益生菌)。从前7天(−7天到0天)，小鼠每天口服(Probio-M9，剂量为4×109 CFU/天)，直到第22天试验结束。两组非益生菌治疗组用等量生理盐水代替益生菌治疗组，对照组用等量细胞培养基代替肿瘤细胞维持治疗，人乳腺癌细胞悬液(5×106 Cells)注射于右腋下。在第12、14、16、18、20和22天，测量小鼠肿瘤大小的变化；第22天处死所有小鼠，采集粪便、血清和肿瘤组织样本。每组随机选取3只小鼠的肿瘤组织，用4%甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行免疫组织化学检测。粪便样本采集后进行宏基因组测序；收集的血清样本进行细胞因子和代谢组学分析；最后用R进行统计分析。

图1 实验设计图。

前言

近年来，乳腺癌已成为女性最常见的癌症之一，也是整体中最常见的癌症。全球大约15-20%的癌症病例是由微生物发病机制引起的，更多的恶性肿瘤是由肠道生态失调引起的。据报道，脑癌、乳腺癌、肺癌和其他肿瘤样本包含肿瘤类型特异性的细胞内细菌，定位于肿瘤细胞和免疫细胞。因此，肿瘤内的物质环境可以被认为是一个复杂的动态微生态系统，受宿主免疫、肿瘤相关微生物群和肿瘤三方相互作用的调控。

人类结肠环境中居住着大量与人类共同进化的肠道菌群。肠道菌群参与生理稳态，包括减少全身炎症和形成先天和适应性免疫能力。在宿主免疫和肠道菌群之间存在着微妙的共生平衡。但如果这种平衡状态被打乱，肠道微生物失调和随后的病理过程就会发生。例如，肠道微生物可能通过代谢产物的产生和调节宿主免疫状态对细胞信号通路的影响，在癌症的发生和发展中发挥作用。分子生物学的最新进展使与肠道微生物有关的癌症发病机制得以广泛研究。与类似的健康女性相比，新诊断出乳腺癌的绝经后女性的粪便菌群多样性较小，粪便菌群组成改变，这些癌症受试者的尿雌激素水平升高，这表明肠道微生物组在乳腺癌中可能起作用。短链脂肪酸(SCFAs)是另一组重要的肠道微生物代谢产物，可直接作用于各种肠道免疫细胞。绝经前乳腺癌患者结肠SCFAs水平明显下降，表明SCFAs在绝经前乳腺癌的病理机制中起关键作用。

Probio-M9是一种从健康女性母乳中分离出来的新型益生菌菌株，已被证明通过调节肠道环境和炎症来抑制大肠肿瘤的形成。基于免疫检查点抑制剂的免疫治疗已显示出良好的临床效果。我们之前的研究表明，免疫检查点抑制剂的全面抗肿瘤作用需要相对完整的宿主肠道菌群，并且在抗生素治疗的小鼠中，给予Probio-M9可以与炎症性乳腺癌治疗协同抑制肿瘤。此外，我们在大鼠模型中的初步工作表明，口服灌胃后，Probio-M9可在乳腺和肠系膜淋巴结中被检测到，这表明存在通过淋巴系统的肠-乳腺通路。这些观察结果表明，Probio-M9在摄入后可以转移到乳腺，并可能在乳腺组织中产生有益作用。因此，本研究假设Probio-M9也可以通过调节宿主肠道菌群、免疫和代谢来抑制乳腺肿瘤的生长。

结果

1 Probio-M9可减缓小鼠肿瘤生长

在整个试验过程中，对小鼠的体重进行了监测。对照组和益生菌组的体重增加较模型组明显，但在大多数时间点均无显著差异(图2b)，说明肿瘤移植在一定程度上抑制了小鼠体重增加，但补充Probio-M9可减轻这种影响。第22天，益生菌组小鼠体重显著高于模型组(益生菌组和模型组的平均体重±SEM分别为19.03±0.81 g和18.41±0.77 g，p=0.047；图2b)。

为了评估益生菌给药后的抗肿瘤效果，在第12~22天，每隔一天比较益生菌组与模型组的肿瘤生长情况(以肿瘤体积表示)。两组肿瘤生长均呈上升趋势；然而，与模型组相比，益生菌组小鼠的肿瘤体积普遍较小(图2c)。从第14天开始观察到肿瘤体积的明显差异，尽管仅在第16、20和22天发现了显著的组间差异(益生菌和模型组的平均肿瘤大小±SEM=214.60±16.61 mm3和166.05±15.62 mm3，453.88±39.59 mm3和339.92±26.66 mm3，659.38±49.19 mm3和496.04 ± 55.70 mm3；p=0.046，0.046和0.04；图2d)。事实上，即使在第14天和第18天，特别是第18天，肿瘤体积的组内差异也只是略微不显著(p=0.089和0.053；图2d)。这些结果表明，补充Probio-M9可减缓肿瘤生长。

图2 实验设计与小鼠肿瘤体积变化。

(a)将36只小鼠随机分为对照组、模型组和益生菌组(每组n=12)，进行不同的干预。第0天将肿瘤细胞移植到模型组和益生菌组小鼠体内。在第12天至第22天期间，每隔一天监测一次肿瘤生长情况。第22天处死小鼠，采集肿瘤组织、粪便和血液样本。(b)折线图显示小鼠体重随时间的变化。误差条表示平均值的标准误差。*代表P<0.05 (模型组与益生菌组比较)，Wilcoxon检验。(c)折线图显示小鼠肿瘤体积随时间的平均变化。误差条表示平均值的标准误差。星号表示组内差异显著，*代表p<0.05，Wilcoxon检验。(d)箱形图显示干预过程中肿瘤体积的变化。各组间两两比较均采用Wilcoxon检验计算P值。(原文图1)

2 Probio-M9可调节小鼠肠道菌群

分析了肠道菌群的组内差异。通过Shannon多样性指数评估小鼠粪便菌群的α多样性。模型组小鼠的Shannon多样性指数值不显著低于对照组，但显著低于益生菌组(p=0.05；图3a)。然后通过主坐标分析(Bray-Curtis距离)，观察各组间肠道菌群结构的差异(图3b)，发现对照组和益生菌组(R2 = 0.096、p=0.043)、模型组和益生菌组(R2 = 0.094，p=0.037)的肠道菌群结构(图3b)存在显著差异，而对照组和模型组之间没有差异(R2=0.045，p=0.6；图3b)。尽管在肠道菌群中观察到一些显著的组间差异，但它们并不剧烈，这与之前发表的许多小鼠模型益生菌干预试验一致。

共注释了119个SGBs (表S1)，其中最丰富的三个种分别是Alistipes sp._1 (4.11%)、Prevotella sp. MGM2(3.99%)和Bacteroides acidifaciens(3.74%)。为了进一步分析益生菌给药对小鼠肠道菌群组成的影响，我们鉴定了对益生菌处理敏感的显著差异丰富的物种。总体而言，模型组和益生菌组之间有14个显著差异丰富物种(所有情况均p<0.05；图3c和表S2)。与模型组相比，益生菌组粪便中7种响应的SGBs(Bacteroidales bacterium 55_9、Porphyromonadaceae bacterium_7、Rikenellaceae bacterium_2和Alistipes属的成员)的菌群明显富集，而其他SGBs，Oscillibacter sp.、Eubacterium sp. 14-2_2、Hungatella hathewayi_1等的菌群则呈现相反的趋势。此外，模型组与对照组之间存在显著差异(与对照组相比，模型组Muribaculaceae bacterium Isolate-013 (NCI)_3和Helicobacter japonicus显著减少，而Duncaniella freteri和Lactobacillus taiwanensis显著增加；p<0.05；表S2)；对照组和益生菌组存在显著差异(与对照组相比，益生菌组Clostridiales和Desulfovibrio sp.显著减少，但Rikenellaceae显著增加；p<0.05；表S2)。这些结果表明，小鼠肠道菌群中的某些类群可能对Probio-M9干预有反应。

图3 小鼠粪便宏基因组数据集的微生物多样性和物种水平基因组分箱(SGB)特征。

(a)对照组(Con)、模型组(Mod)和益生菌组(Pro)第22天Shannon多样性指数。(b)粪便菌群的主坐标分析评分图(PCoA；Bray−Curtis距离)。代表两组样本的符号用不同的颜色表示。(c)在第22天，益生菌组和模型组之间的响应性SGBs显示出显著的丰度差异(p<0.05；Wilcoxon检验)。(原文图2)

3 Probio-M9可调节小鼠血清和肿瘤细胞因子水平

采用ProcartaPlex多重免疫分析法评估各组间血清细胞因子谱的差异。大多数细胞因子在两组间没有显著差异(数据未显示)。但与模型组相比，益生菌组监测的部分细胞因子血清水平显著升高，包括IFN-γ、IL-9、IL-13和IL-27，而IL-5水平显著降低(所有情况均p<0.05；图4a)。此外，模型组的血清IL-5水平明显高于对照组，IL-27水平则相反。益生菌抑制了血清IL-5和IL-27水平波动(所有情况p<0.05；图4a)。肿瘤组织的组织化学检测显示，益生菌组和模型组之间IL-9、IL-27和IL-5RA阳性细胞的丰度和表达存在差异，这种差异与血清细胞因子谱的变化一致(图4b，c)。这些结果表明，摄入Probio-M9可调节宿主免疫。

图4 第22天，对照组(Con)、模型组(Mod)和益生菌组(Pro)肿瘤组织血清细胞因子水平及细胞因子组织化学染色。

(a)采用Wilcoxon检验评估各组间血清中干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-13、IL-9、IL-5和IL-27浓度的差异。(b) Mod组和Pro组肿瘤组织代表性切片IL-5RA、IL-9、IL-27的免疫组化(IHC)，放大25×(比例尺为200 μm)。(c)用Wilcoxon检验评估Mod组和Pro组间IHC的平均光密度(AOD)。(原文图3)

4 Probio-M9可调节小鼠血清代谢组

为了进一步揭示小鼠对Probio-M9干预的生理反应，我们分析了血清代谢组的组间差异。通过主坐标分析，在所有三对比较中观察到血清代谢组的显著差异，这可以通过各自主坐标分析评分图上不同的基于组的聚类模式来说明。对照组和模型组血清代谢组的符号显示出明显的组的聚类趋势(图5a；p=0.001)，说明肿瘤移植小鼠血清代谢组与未进行肿瘤移植的对照组相比存在显著差异。益生菌组的血清代谢组与对照组或模型组也有显著差异(p=0.001；图5a)，说明Probio-M9可调节乳腺癌和对照组小鼠的血清代谢组。

偏最小二乘判别分析(临界水平：VIP评分>2，p<0.05)鉴定出大量差异丰富的血清代谢物，包括对照组和模型组之间的27种代谢物，对照组和益生菌组之间的42种代谢物，益生菌和模型组之间的35种代谢物(表S3)。将鉴定出的特征与血液暴露数据库进行比较，其中分别标注了21、27和21个代谢物特征(表S3)。有趣的是，与模型组相比，益生菌组富集了几种代谢物(如吡哆醛、烟酸、3-羟基丁酸、半乳糖酸、犬尿氨酸和谷氨酰胺)(p<0.05；图5b)。另一方面，与益生菌组相比，一些已知与小鼠乳腺肿瘤相关的化合物(如肌醇和乳酸)在模型组中富集(p<0.05；图5b)。这些结果表明，Probio-M9的干预可能与宿主血清代谢组结构和组成的变化有关。

图5 对照组(Con)、模型组(Mod)和益生菌组(Pro)组在第22天的血清代谢组的比较。

(a)各组间血清代谢组的主坐标分析评分图(PCoA；Bray-Curtis距离)。(b)注释显著差异代谢物：Con vs. Mod组；Con vs. Pro组；Mod vs. Pro组，采用液相色谱-质谱法检测。临界值：VIP评分>2和p<0.05。(原文图4)

5 肿瘤生长抑制与肠道菌群、血清细胞因子及代谢产物的相关性

通过相关性分析探讨小鼠肿瘤体积与肠道菌群、血清细胞因子和代谢物之间的关系(表S4)。观察到一些有趣的相关性，例如，肿瘤体积与谷氨酰胺呈负相关(r=−0.684，p=0.029)。Doreasp. 5-2与IL-9、IL-13呈显著正相关(r>0.670，p<0.034)，而Alistipes sp. CHKCI003与IL-5、烟酸和半乳糖酸呈负相关(所有情况r<−0.654，p<0.05)。

讨论

乳腺癌是女性最常见的癌症之一。鉴于肠道菌群与癌症发病机制之间存在密切关系，且益生菌管理有能力恢复健康的肠道菌群，本研究分析了Probio-M9对癌细胞移植小鼠乳腺肿瘤生长的保护作用。

尽管越来越多的证据支持益生菌是一种很有前途的癌症治疗策略，包括乳腺癌，但据报道临床结果不一致，这可能是益生菌菌株特异性有益功能的结果。本研究之所以选择评估Probio-M9的抑瘤效果，是因为它在小鼠模型中与免疫疗法联合应用时表现出了显著的抑制结肠癌的效果，并在乳腺肿瘤治疗中发挥了协同治疗作用。本研究证实了Probio-M9在癌细胞移植小鼠中也能有效抑制乳腺肿瘤的生长。本研究中益生菌组小鼠在肿瘤移植前7天灌胃益生菌，肿瘤移植后16天，益生菌组与模型组肿瘤体积有显著差异，但在第14天肿瘤体积已经有明显差异趋势(p=0.089)。在肿瘤移植第12天，在模型组(2只)和益生菌组(3只)相同数量的小鼠中均未检测到明显的肿瘤肿块。这些结果表明，益生菌干预对抑制乳腺肿瘤生长有效。为了确定潜在的抗肿瘤机制，随后分析了模型组和益生菌组之间肠道微生物组、细胞因子谱和血清代谢组的差异。

微生物宏基因组测序和深入的生物信息学分析显示，模型组的Shannon多样性指数有所下降，但下降不显著。然而，人们普遍认为较高的肠道微生物多样性对宿主是有益的。本研究结果显示，应用益生菌可以使肿瘤移植小鼠的肠道菌群多样性恢复到与对照组相似的水平，这是可取的；此外主坐标分析结果显示，益生菌组粪便菌群中Alistipes sp._2、Alistipes sp._3和Rikenellaceae bacterum_2富集，Alistipes是Rikenellaceae科的一个属，该属可与其他肠道微生物共同产生抗炎代谢产物，发挥抑瘤作用，对结肠炎、肝纤维化等疾病有保护作用。因此，益生菌作为肠道菌群调节剂，可以用作利用宿主肠道微生物组增强对肿瘤生长的抵抗力的工具；此外，与模型组相比，益生菌组粪便菌群中Oscillibacter sp.、Hungatella hathewayi_1和Eubacterium sp. 14-2_2明显减少。虽然这些微生物是正常肠道菌群的一部分，但在次优条件下，它们可能会作为机会致病菌，因此，Probio-M9抑制肿瘤作用的一种可能机制是抑制乳腺荷瘤小鼠肠道环境中的某些机会微生物。

丰富多样的肠道菌群是宿主免疫系统健康发育和成熟的先决条件，细胞因子已被证明可以调节乳腺肿瘤中雌激素的合成。因此我们评估了Probio-M9对肿瘤移植小鼠免疫的影响。益生菌组小鼠血清IFN-γ浓度显著高于模型组。IFN-γ在抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡中起直接作用。先前的一项研究报道表明，给予嗜酸乳杆菌可增加诱导的小鼠乳腺癌模型中的IFN-γ水平。此外，在乳腺癌患者中观察到Th1/Th2失衡偏向于Th2反应，Th1显性反应增加了患者的生存率，同时降低了癌症复发的几率。我们的研究发现，益生菌的施用使Th1/Th2的平衡更多地向Th1反应转变，其特征是血清IL-5水平下降，但IL-9、IL-27和IFN-γ增加，表明Probio-M9可以增强小鼠乳腺肿瘤的免疫功能，并更多地转向Th1反应。此外，Probio-M9给药小鼠的血清代谢组烟酸(维生素B3的常见形式)、吡哆胺(维生素B6)和氨基酸衍生物(包括谷氨酰胺、犬尿氨酸和3-羟基丁酸)水平显著升高，对肠道健康、肿瘤体积等都有益。

综上所述，当前的小鼠模型是一个初步研究，显示了益生菌鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9在减缓移植乳腺肿瘤生长方面的有益作用，并且这种作用伴随着大量宿主肠道菌群、免疫和代谢反应(图6)。本研究的结果仍需要更大规模的研究和人类临床研究来进一步验证。

图6 鼠李糖乳杆菌Probio-M9抑制乳腺肿瘤生长的机制。(原文图5)

结论

本研究将小鼠分为对照组、模型组和益生菌组，探究了鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9对癌细胞移植小鼠乳腺肿瘤生长的保护作用。为了确定潜在的抗肿瘤机制，随后分析了肿瘤体积、肠道菌群、炎症因子和血清代谢物差异。研究表明，益生菌能有效减缓移植乳腺肿瘤的生长，其在抗肿瘤的预防和/或治疗作用值得进一步的临床研究。