【论肿道麻】伤害性感受神经元影响肿瘤免疫监视

实体肿瘤受自主神经系统和感觉末梢神经系统的神经纤维支配。然而，疼痛感觉神经元对肿瘤的神经支配是否影响肿瘤免疫监测尚不清楚。最近，加拿大蒙特利尔大学Sebastien Talbot教授课题组在《Nature》上发表了的一项题为《Nociceptor neurons affect cancer immunosurveillance》最新研究成果。研究发现：黑色素瘤细胞与伤害性感受神经元相互作用，可促进其轴突生长，增强配体的反应性，刺激神经肽释放。降钙素基因相关肽（CGRP）是一种伤害感受器产生的神经肽，直接增加了细胞毒性CD8+T细胞的耗竭，从而限制了它们消除黑色素瘤的能力。TRPV1谱系的基因剪切、伤害性感受器的局部沉默和CGRP受体RAMP1的拮抗都能减少肿瘤浸润性免疫细胞的耗损，并抑制肿瘤生长。本文结果表明，通过消除CGRP对细胞毒性CD8+ T细胞的免疫调节作用，减少肿瘤神经伤害性感受器中CGRP的释放可能是提高抗肿瘤免疫的一种策略。现介绍如下：  

前言：

细胞毒性T细胞表达多种受体，包括PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)、LAG3(淋巴细胞激活基因蛋白-3)和TIM3 (T细胞免疫球蛋白和黏液蛋白域蛋白3)，这些受体被其同源配体激活后可抑制T细胞的功能。这些受体控制损伤或感染的免疫反应，从而防止损害健康细胞的过度反应。肿瘤细胞为这些免疫受体表达配体，当这些受体被激活时，会阻断T细胞的细胞溶解功能，从而有利于癌细胞的存活。  

在前列腺肿瘤中，表达双皮质素的神经祖细胞激活肾上腺素能神经元，可促进肿瘤的发展和扩散。在头颈部肿瘤中，TP53的缺失促使肿瘤支配感觉神经重新编程为促进肿瘤生长的肾上腺素能神经元。由于肿瘤中出现这种新神经支配，以及神经肽对免疫细胞的不同作用，本文研究激活伤害性感受器，局部释放神经肽是否可通过抑制免疫监视来促进肿瘤生长。  

黑色素瘤受神经支配

尽管在人类肿瘤细胞或免疫细胞中，RNA测序未检测到神经元起源基因的表达，但研究者在黑色素瘤患者的标本活检中观察到它们的表达显著增加。由于这些临床数据表明黑色素瘤的神经支配增加，本文通过评估黑色素瘤患者活组织检查中的TRPV1+神经元来检测伤害性感受神经元的存在。活检结果显示，肿瘤中TRPV1免疫印记比相邻健康组织增加约两倍，且肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的数量与TRPV1免疫标记的增加相关。这些数据表明，黑色素瘤受感觉神经元支配，这些神经元可能影响肿瘤内免疫细胞的数量。  

研究者将表达GFP的黑色素瘤(B16F10-eGFP)细胞系接种到小鼠中，发现肿瘤周围和肿瘤内部有大量的 NaV1.8+ 伤害受体神经元(图1a)。对携带B16F10小鼠样本的RNA测序显示，黑色素瘤浸润性免疫细胞没有检测到神经元标记(NaV1.8 或TRPV1)水平，表明NaV1.8信号可能归因于肿瘤浸润性神经。接着，研究者用体外共培养方法来评估肿瘤细胞是否调节伤害性感受神经元的功能。TRPV1+伤害性感受神经元在共培养时，直接向黑色素瘤细胞延伸轴突，而整体神经元分支减少。总之，当伤害性感受神经元靠近黑色素瘤细胞时，促进其生长，感觉神经元副枝直接出芽进入瘤床。这种肿瘤的新神经支配类似于肿瘤的新血管生成。

黑色素瘤细胞敏化伤害性感受器

鉴于黑色素瘤促进轴突生成，致使神经支配肿瘤，研究者研究了这种现象是否促进黑色素瘤调节伤害性感受器的敏感性。研究者测量了钙通量在各种有害配体低于阈值浓度时的变化。当伤害性感受器在没有黑色素瘤细胞的情况下培养时，很少对所选浓度的配体有反应。而与B16F10细胞共培养时，反应神经元数量增加(图1b)。同样，与对照组相比，在接种了14天肿瘤的小鼠的同侧收集的腰椎DRG神经元(L3-L5)中钙通量响应的振幅更大。因此，黑色素瘤释放的信号增强了伤害性感受器的敏感性。本文测试了这种神经敏化是否会导致免疫调节神经肽的释放增加。与单独B16F10细胞相比，DRG神经元与B16F10细胞共培养能在培养基中释放CGRP(图1c)。

图1 黑色素瘤细胞敏化伤害性感受器

基于此，本文进一步测试暴露于黑色素瘤是否会改变伤害性感受神经元的转录组。为此，研究者单独培养或与黑色素瘤细胞联合培养原始DRG神经元。48 h后用荧光激活细胞分选法(FACS)纯化TRPV1+伤害性感受神经元，并对其进行RNA测序。计算差异表达基因(DEGs)，发现暴露于肿瘤的伤害性感受器中，编码CGRP的calca基因和NGF受体Trka过表达(图1d-e)。Trka的过表达可能有助于驱动黑色素瘤诱导的疼痛敏化，而CGRP激活伤害性感受器，可能对TILs进行免疫调节。为了确定黑色素瘤使伤害感受器神经元敏感化的机制，研究者使用了一种共培养系统，旨在模拟黑色素瘤微环境中发生的相互作用。Tc1刺激OVA特异性细胞毒性CD8＋T细胞、原始DRG神经元和B16F10-mCherry-OVA黑素瘤细胞单独或联合培养。48 h后收集细胞，进行FACS纯化和RNA测序，计算DEGs。其中发现Slpi(分泌型白细胞蛋白酶抑制剂)在与DRG神经元或OVA特异性细胞毒性CD8+ T细胞共培养时，以及暴露于两个种群时，在黑色素瘤细胞中过表达(图2a,b)。此外，当黑色素瘤细胞与原始DRG神经元和OVA特异性细胞毒性CD8+ T细胞共培养时，Slpi分泌增加到培养基中，这种效果在48 h后达到最大(图2 c)。  

Slpi在痛觉中的作用尚不清楚。为了解决这个问题，研究者测量Slpi是否直接激活DRG神经元，发现Slpi 激活了约20%的DRG神经元，Slpi敏感神经元大部分较小(图2d,e)。鉴于Slpi触发钙内流，研究者研究了这是否是B16F10细胞驱动神经元释放CGRP的方式(图1c)。Slpi在与黑色素瘤细胞分泌的浓度相似的情况下(图2c)，可诱导原始DRG神经元释放CGRP(图2f)。最后，研究者在体内测试Slpi是否可以敏化痛觉，发现当Slpi被注射到初生小鼠的右后爪时，会产生短暂的热过敏。  

黑色素瘤分泌的Slpi作用于伤害性感受器，触发钙内流、神经肽释放和热超敏反应，表明这些感觉神经元检测到癌细胞的存在并作出反应。这是否使癌细胞比宿主细胞有功能上的优势尚不清楚。为了评估这一点，将B16F10-mCherry-OVA细胞植入8周龄雌雄小鼠的后爪，发现肿瘤较大的小鼠肿瘤内PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞比例更高，对热痛更敏感(图3a)。

图2 肿瘤分泌的SLPI驱动伤害性感受神经元释放CGRP 

黑色素瘤神经支配伤害性感受器控制肿瘤生长

肿瘤中肾上腺素能和胆碱能轴突标记物的表达与临床预后不良相关。为了研究癌症、伤害性感受器和CD8+ T细胞之间相互作用的本质，研究者使用三阴性黑色素瘤的同基因小鼠模型。将 B16F10-mCherry-OVA细胞接种于8周龄伤害感受器切除或完好小鼠。在切除伤害性感受器的小鼠中，中位生存期增加了2.5倍(图3 b)。在另一组小鼠中，研究者在肿瘤接种后16天发现伤害性感受器基因剪切减少了肿瘤生长(图3c)。此外，这些伤害性感受器基因剪切小鼠显示细胞毒性肿瘤浸润的CD8+ T细胞的总数和相对频率增加，但PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞比例减少(图3d,e)。  

数据表明，伤害性感受神经元是肿瘤内PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞的上游驱动因子。为进一步验证，研究者绘制了热痛超敏反应动力学，瘤内PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+T 细胞频率与肿瘤生长的关系图。当与基线阈值和感觉神经元切除小鼠相比，对照小鼠接种 B16F10-mCherry-OVA后，在第7天表现出明显的热敏感，在第21天达到峰值。在这些小鼠中，肿瘤接种后12天，PD-1+LAG3+TIM3+ 或IFNγ+CD8+ T细胞的瘤内频率显著增加，并在第19天达到峰值。最后，黑色素瘤体积在第22天达到峰值。这表明，热超敏先于瘤内CD8+ T细胞明显衰竭约5天，而疼痛超敏在肿瘤增大之前就已出现。  

阻断免疫检查点蛋白的活性可增强免疫系统消除肿瘤的能力。免疫检查点抑制剂(ICIs)，包括靶向PD-L1的抑制剂，可改善转移性黑色素瘤患者的临床预后。然而，ICIs的疗效在患者中差异很大，近一半的患者不会受益。此外研究者评估肿瘤神经支配伤害性感受神经元的存在或缺失是否会影响抗PD- L1治疗的效果。接种了黑色素瘤细胞的小鼠或已形成肿瘤的小鼠给予抗PD- L1治疗。在这两种情况下，伤害性感受器切除可增加抗PD- L1介导的肿瘤消退及肿瘤特异性CD8+细胞的浸润。  

为了测试在没有伤害性感受神经元的情况下肿瘤生长减少是否取决于它们对免疫细胞的作用，比较了伤害性感受器对免疫原性和非免疫原性等基因黑色素瘤模型生长的影响。YUMMER1.7用来诱导黑色素瘤的临床模型。接种黑色素瘤细胞的情况下，切除伤害性感受器限制了肿瘤的生长，并降低了瘤内PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞的频率。然而，YUMM1.7 在存在和不存在伤害性感受器的情况下肿瘤生长和瘤内PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞的频率相似。  

本文评估了这些差异是否由于伤害性感受神经元直接调节瘤内T细胞。研究者发现在CD8+(图3f)或CD3+ T细胞系统性耗损后，伤害性感受器完好和切除小鼠之间的肿瘤生长没有发生明显变化。尽管在黑色素瘤细胞接种的小鼠中，树脂毒素(RTX)对伤害受体神经元进行化学切除可以减少肿瘤生长，但研究者发现，当移植到RTX暴露的Rag1−/−小鼠中时，幼稚的OT-I CD8+ T细胞使肿瘤缩小(图3g)。在此过程中，伤害性感受神经元的化学切除使幼稚的OT-I CD8+ T细胞免于衰竭(图3h)。这些数据表明，小鼠肿瘤生长快慢取决于伤害性感受器对CD8+ T细胞的调节。

图3伤害性感受器的基因剪切保障了抗肿瘤免疫 

皮肤伤害性感受神经元的光遗传学激活神经肽的逆向释放，这些神经肽介导对微生物的免疫并增强皮肤免疫力。研究者使用透皮照射刺激肿瘤神经支配的NaV1.8+ 光敏通道表达神经元。当暴露在可见(约20mm3)或确定(约200mm3)肿瘤的小鼠身上时，每日蓝光刺激增强了黑色素瘤的生长。肿瘤体积的增加也与瘤内CGRP水平的增加有关，证实了疼痛传递神经元的参与。激光照射对光不敏感小鼠的肿瘤生长无影响。  

新生儿或胚胎期对神经元亚群的切除可能导致代偿性改变。为了避免这种可能性，研究者使用肉毒杆菌神经毒素A (BoNT/A)沉默神经元，这种神经毒性蛋白通过裂解SNAP25起作用。BoNT/A可使支配皮肤神经元释放的神经递质持久消失。BoNT/A可以减少前列腺癌的肿瘤生长，并在皮肤感染过程中阻断伤害性感受器介导的中性粒细胞调节。BoNT/A不影响体外培养的B16F10或CD8＋ T细胞的功能。当BoNT/A 在黑色素瘤细胞接种前1天和3天注射时，它可以减少肿瘤的后续生长，并保留瘤内CD8＋ T细胞的细胞毒潜能。BoNT/A预处理也减少了YUMMER1.7肿瘤的生长，增强了抗PD - L1介导的肿瘤消退。当给有肿瘤的小鼠注射BoNT/A时，其疗效有限。将BoNT/A给予TRPV1伤害性感受神经元被切除的小鼠时，也不会影响肿瘤生长，这表明其抗肿瘤有效性取决于肿瘤支配的伤害性感受神经元的存在。

接着，本文测试了伤害性感受器选择性沉默的抗肿瘤功效。该方案使用大孔离子通道(TRPV1)作为细胞特异性药物入口端，传递QX -314，以阻断电压门控钠通道。有炎症时这些大孔离子通道打开，使QX-314渗透到神经元中，并导致持久的电阻断。尽管QX-314在体外不影响黑色素瘤细胞或CD8+ T细胞的功能，但研究者证实它在体内可以抑制肿瘤神经支配的伤害性感受器，如减少B16F10诱导的CGRP释放和痛觉敏化。研究者发现，暴露B16B10 - mcherry - OVA携带小鼠的死亡率是QX -314暴露小鼠的2.7倍。在肿瘤接种后17天观察，QX -314介导的感觉神经元沉默,减少了黑色素瘤的生长，限制了肿瘤内CD8+ T细胞的衰竭。伤害性感受器沉默也增加了肿瘤内CD8+ T细胞的数量，并保留了它们的细胞毒性潜能及增殖能力。与在伤害性感受器切除小鼠中观察到的情况类似，使用QX-314沉默肿瘤支配神经元增强了抗PD- L1介导的肿瘤消退。当QX-314给已有黑色素瘤的小鼠时，QX-314仍然减少了肿瘤的生长，并保留了CD8+ T细胞的抗肿瘤能力，这表明QX-314可以作为一种癌症治疗药物。

CGRP可减弱RAMP1+ CD8+ T细胞的活性

在乳腺癌中，肿瘤特异性交感神经去神经下调TILs中PD-L1、PD-1和FOXP3的表达。人和小鼠细胞毒性CD8+ T细胞表达多种神经肽受体，包括CGRP受体RAMP1。考虑到伤害性感受器在培养中很容易与CD8 T+ 细胞相互作用，并且它们释放的神经肽阻断了抗菌免疫，研究者测试这些介质是否驱动CD8 T+ 细胞中免疫检查点受体的表达。Tc1激活的CD8+ T细胞与DRG神经元共培养4天，研究者发现辣椒素刺激伤害性感受器增加了表达PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞的比例，但降低了IFNγ、TNF和IL-2的水平。在缺乏DRG神经元的情况下，辣椒素对CD8+ T细胞没有影响。KCl 刺激DRG神经元中收集的培养基干预Tc1激活的CD8+ T细胞，这增加了PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞的比例，减少了IFNγ细胞的比例。当细胞毒性CD8+ T细胞用来自BoNT/ a沉默神经元的KCL诱导培养基或当它们共同暴露于RAMP1阻断剂,这些效应被阻断。为了证实伤害性感受器释放的神经肽驱动T细胞衰竭，研究者将Tc1激活的CD8+ T细胞暴露于CGRP。表达野生型RAMP1的CGRP处理细胞表现出疲竭加剧和细胞毒性潜能下降。从CGRP受体敲除(Ramp1++−/−)小鼠收集的CD8+T细胞中，这些作用不存在(图9e,f)。  

伤害性感受器产生的神经肽降低了对细菌和真菌的免疫力，并促进细胞毒性CD8+ T细胞衰竭(图4a,b)。考虑到当与B16F10细胞一起培养(图1c)或暴露于Slpi(图2f)时，伤害性感受器释放的CGRP增加，并且肿瘤浸润的伤害受体神经元过表达Calca(图1d,e)，研究者下一步试图测试肿瘤内CGRP水平是否与CD8+ T细胞衰竭相关。为此，研究者以白喉毒素切除机械和热敏伤害性感受器。与携带黑色素瘤的同胎对照相比，切除NaV1.8+感觉神经元保留了瘤内CD8+ T细胞的功能。在两组小鼠中，瘤内CGRP比例与PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞的频率直接相关。  

然后研究者开始增加感觉神经元切除小鼠的CGRP水平(通过每日瘤内注射)，并测量其对肿瘤生长和TIL衰竭的影响。在接种后11天，CGRP处理的感觉神经元切除小鼠与伤害性感受器完整小鼠的肿瘤生长和CD8+ T细胞衰竭相似(图4c)。接下来，研究者用选择性RAMP1拮抗剂BIBN4096 治疗肿瘤小鼠。BIBN4096暴露小鼠的死亡率比暴露B16F10小鼠的死亡率低2.6倍。在第13天测量时，BIBN4096 降低了B16F10的生长、PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞的肿瘤重量和频率(图4d-e)。由于BIBN4096给伤害性感受器切除小鼠没有效果，也不影响体外培养的B16F10细胞或CD8 T细胞功能，研究者得出结论，BIBN4096的抗肿瘤特性依赖于活性的伤害性感受神经元的存在。

图4  CGRP调节CD8+ T细胞的活化

为了直接确定RAMP1是否是CD8+ T细胞耗竭的主要驱动因素，研究者移植了RAMP1−/−或RAMP1野生型(Ramp1WT) CD8+ T细胞的Rag1−/−小鼠或两者的1:1混合。尽管研究者在所有三组中提取了相似数量的CD8+ T细胞，但在接受Ramp1−/−CD8+ T细胞的小鼠中发现黑色素瘤瘤生长受限(图5a)，而这些细胞对CGRP没有反应。Ramp1−/−移植的小鼠瘤内PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞的相对比例也较低。在与表达Ramp1和不表达CD8+ T细胞共同移植的小鼠中，研究者发现在同一肿瘤中，Ramp1−/−CD8+ T细胞瘤内PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T细胞的相对比例较低(图5b)。接下来，研究者对这些肿瘤中经FACS纯化的Ramp1WT和Ramp1−/−CD8+ T细胞进行了RNA测序。与Ramp1WT相比，研究者发现瘤内Ramp1−/−CD8+ T细胞表达促衰竭转录因子(Tox和Eomes)、标记物(Pdcd1(编码PD-1)、Lag3和Tim3更少(图5 c)。总的来说，无CGRP反应的Ramp1−/−CD8+ T细胞在遭受伤害性感受器诱导的衰竭时受到保护，这保障了它们的抗肿瘤反应。  

与良性痣相比，患者黑色素瘤Calca表达增加。与伤害性感受神经元的其他标记物一起，RAMP1在这些活检中过表达与患者生存率降低相关(图5d)。RAMP1是否通过影响瘤内CD8+ T细胞衰竭来达到此目的尚不清楚。为了回答这个问题，研究者分析了两个独立的人类黑色素瘤单细胞RNA测序数据集，发现约1.5%的肿瘤浸润CD8＋T细胞表达RAMP1。患者黑色素瘤浸润性RAMP1＋ CD8＋ T细胞过表达免疫检查点受体PD-1、TIM3 (HAVCR2)、LAG3、CTLA4和CD27(图5e)。该分析还显示，从对ICIs耐药的患者中收集的肿瘤浸润CD8＋细胞明显过表达RAMP1。这样的表达谱类似于效应因子CD8+ T细胞的功能衰竭，这表明CGRP受体RAMP1影响了黑色素瘤患者中CD8+ T细胞的衰竭和对ICI的临床反应。

图5 CGRP可减弱RAMP1+ CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫

总结：

总的来说，通过系统的细胞实验和动物实验相结合，Sebastien等证实黑色素肿瘤细胞分泌的SLPI驱动伤害感受神经元释放CGRP，进而通过CGRP-RAMP1信号轴诱导CD8+T细胞耗竭，从而促进黑色素肿瘤生长。他们发现，活化伤害感受神经元分泌的神经肽是感觉神经促进肿瘤生长的关键纽带，深入揭示了肿瘤细胞、伤害感受神经元以及CD8+T细胞三者间的相互作用。  

伤害性感受神经元的基因编辑可通过阻止CD8+T细胞衰竭来减少B16F10肿瘤的生长，而外源性给予CGRP的作用则相反。这些作用仅限于免疫原性肿瘤，在缺乏CD8+T细胞的情况下不起作用。同样，肿瘤患者标本的数据表明，表达RAMP1的CD8+T细胞更容易衰竭，并与对ICIs反应性较低有关。肿瘤神经支配性伤害性感受器通过上调细胞毒性CD8+T细胞上的多个免疫检查点受体来抑制对黑色素瘤的免疫反应。阻断CGRP-RAMP1轴减弱神经系统对CD8+ T细胞的免疫调节作用，从而保护宿主的抗肿瘤免疫，并通过中断促肿瘤神经免疫联系提供潜在的治疗机会。  

编译：吴园园，张祥

审校：张军，缪长虹

参考文献：Balood M, Ahmadi M, Eichwald T. et al. Nociceptor neurons affect cancer immunosurveillance. Nature. 2022 Nov;611(7935):405-412. doi: 10.1038/s41586-022-05374-w. Epub 2022 Nov 2.  

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