【话险危夷】维生素D结合蛋白在减轻脓毒症肝损伤中的潜在作用

脓毒症是威胁健康的主要病因之一，每1万人中有45人发病，死亡率约为20%。脓毒症可由多种病原体引起，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫，其特征是炎症过度表达、免疫抑制和凝血系统激活。尽管在过去的几十年里，脓毒症的治疗取得了显著的进展，但目前仍没有统一、标准的诊断和治疗方法。

维生素D结合蛋白(VDBP)，也被称为GC-球蛋白，由特定组分(GC)基因编码。VDBP对维生素D和代谢产物(包括25-羟基维生素D [25(OH)D3](主要循环形式)和1,25-二羟基维生素D [1,25(OH)2D3](活性形式))的结合、溶解和运输至关重要。VDBP参与调节多种病理生理过程，包括趋化、骨代谢和炎症反应。先前的研究显示，脓毒症患者血浆VDBP水平低于健康志愿者。此外，脓毒症患者较低的循环VDBP水平与更严重的疾病和死亡率的增加相关。

多器官功能衰竭是脓毒症患者的常见并发症。创伤后多器官功能衰竭和脓毒症患者VDBP血浆水平低于未发生创伤后的患者。大多数接受肝移植的患者血浆VDBP浓度也升高， VDBP在肝损伤和恢复中发挥作用。在目前的研究中，我们首先研究了脓毒症患者VDBP水平与肝损伤之间的关系，然后在培养的肝上皮细胞和脓毒症小鼠模型中进行了一系列实验，以探讨其潜在的机制。

方法

临床研究

研究方案经中国人民解放军总医院伦理委员会批准（S2015-069-01），所有受试者均签署书面知情同意书。2016年5月至2018年5月期间，招募中国人民解放军总医院重症监护室（ICU）脓毒症成年患者（n = 78）。使用脓毒症3.0诊断标准定义脓毒症。根据28天死亡率将患者分为两组：脓毒症存活组[脓毒症（s），n = 43]和脓毒症非存活组[脓毒症（d），n = 35]。于2017年3月至2018年5月招募中国人民解放军总医院体检中心健康成年志愿者50例。排除患有恶性肿瘤或人类免疫缺陷病的受试者（患者或健康志愿者）。在诊断后24小时内死亡或接受免疫抑制治疗的脓毒症患者也被排除。分析前将血清样品保存在-80 ℃冰箱中。

使用匹配的酶联免疫吸附试验（ELISA）商业试剂盒和制造商程序测定人VDBP、25(OH)D3和1,25(OH)2D3血清水平。人VDBP、25(OH)D3和1,25(OH)2D3 ELISA检测试剂盒分别从Abcam（目录号ab223586，剑桥，英国）、免疫诊断系统（目录号AC-57F1，IDS，Boldon，英国）和TSZ Biosciences（Framingham，MA，美国）获得。

动物实验

研究方案经中国人民解放军总医院动物伦理委员会批准（2014-X9-16）。共40只成年雄性C57BL/6小鼠（6周龄；北京生命河实验动物技术有限公司，中国北京）随机分为假手术组（n = 20）和盲肠结扎、穿刺（CLP）组（n = 20）。假手术组或CLP组在手术后的每个时间点（第1、3、5、7天）各取5只小鼠。CLP组的小鼠进行CLP治疗。简单来说，腹腔注射速眠新注射液(中国厦门有限公司)、氯胺酮注射液(福建吉田药业股份有限公司)和生理盐水(体积比=2:1.5:3.5,50 ul/只)联合麻醉小鼠。腹部正中切口1.5 ~ 2.0 cm。从盲肠末端的2/3位置用无菌丝线结扎盲肠，用8号针穿刺2次，轻轻挤压迫使肠内容物进入腹腔，然后关闭切口。一组小鼠接受假手术(同样的麻醉和手术操作但没有盲肠结扎和穿刺)和相同的采样方案的小鼠作为对照。所有小鼠在CLP或假手术后皮下注射预热的生理盐水(0.05 ml/g体重)。

血清VDBP（目录号DY4188-05）、白介素-6（IL-6，目录号M6000B）和肿瘤坏死因子α（TNF-α，目录号MTA00B）使用ELISA试剂盒测定。将肝右叶用10%甲醛稀释，包埋在石蜡中，并按照标准方案切片进行苏木精-伊红（HE）染色。对于免疫组织化学（IHC），用3 % H2O2淬灭组织切片，然后提取抗原。切片用10 % 山羊血清封闭1小时，然后与抗VDBP的一级抗体（1:200稀释，目录号ab153922，Abcam，Cambridge，UK）在37°C下孵育2小时。用适当的二级抗体孵育后，用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）底物（Termo Fisher Scientifc）染色，并用苏木精复染。使用奥林巴斯BH2显微镜（美国宾夕法尼亚州中心谷奥林巴斯）获取图像，使用Image Pro Plus 6.0软件（美国马里兰州Silver Spring Media Cybernetics）进行分析。肝左叶用于Western印迹和RNA分析。

细胞培养物和试剂

转化的人肝上皮细胞系(THLE2)从美国典型培养系(Manassas, VA, USA)中获得，并在含有5 ng/ml表皮生长因子(EGF)、70 ng/ml磷酸乙醇胺和10%胎牛血清的BEGM基础培养基(CC3170-BEGM Bullet Kit, Lonza Corporation, Walkersville, MD, USA)中在37℃含5% CO2的湿化培养箱中培养。编码人VDBP（LV-VDBP）和对照（LV-NC）的重组慢病毒由Hanbio Biotechnology（中国上海）设计。

半胱天冬酶- 3/9活化和氧化应激

Caspase-3 (目录号C1116)和caspase-9 (目录号C1158)活性的测定使用的试剂盒来自Beyotime Biotechnology(上海，中国)。髓过氧化物酶(MPO)活性测定使用Abcam的试剂盒（目录号ab105136）。丙二醛(MDA)水平测定使用Beyotime Biotechnology的试剂盒(目录号S0131S)。谷胱甘肽(GSH)水平测定使用Sigma-Aldrich的试剂盒（目录号CS0260）。

逆转录荧光定量PCR（RT‑qPCR）测定

分别使用RNAprep纯动物组织总RNA提取试剂盒(天根生物技术，北京，中国或Trizol试剂Termo Fisher Scientific)从组织样本或培养细胞中分离总RNA。使用快速定量 cDNA第一链合成试剂盒(天根生物技术)制备cDNA第一链。RT-PCR实验使用KAPA SYBR FAST qPCR试剂盒(Biosystems，Wilmington，DE，USA)进行三次实验。引物序列为:5 ' -GCT GAC CCT GAC TGC TGC TAT GAC -3 '(正向)和5 ' -CAT GCA GAG CTT TCG GTT CC-3 '(反向)用于人类VDBP;5 ' -AGC CTC AAG ATC ATC AGC AAT GCC -3 '(正向)和5 ' -TGT GGT CAT GAG TCC TTC CAC GAT -3 '(反向)用于人类GAPDH。

蛋白质印迹法

组织样本和细胞在玻璃均质器中用预冷RIPAlysis溶液(北京阿普根科技有限公司)裂解，在12000 g下离心10分钟。使用BCA试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测定蛋白质浓度。蛋白质(35 μg/样品)用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上(Millipore, Darmstadt，德国)。用5%脱脂牛奶封闭膜，然后在4 ℃下与抗VDBP（1：5 000稀释，目录号ab81307，Abcam）、c-Jun N-末端激酶（JNK）（1：1 000稀释，目录号#9252，细胞信号技术）或磷酸化JNK（p-JNK）（1：2 000稀释，目录号#9255，细胞信号技术）尽量避免过夜孵育。然后将膜与适当的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（中山金桥生物技术）孵育1小时。使用ECL试剂盒（Thermo Fisher Scientific）观察目的蛋白条带。

细胞活力

将对数生长期细胞（104/孔）接种于96孔板中。将细胞暴露于脂多糖（LPS）（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）24小时，向每个孔中加入90 μl新鲜培养基和10 μl 3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT，5 mg/ml）溶液。4小时后，吸出培养基，向每个孔中加入180 μl二甲基亚砜（DMSO），持续10分钟，以溶解生成的甲氧基复合物。在492 nm处测量吸光度。

细胞凋亡

使用流式细胞术（BD Biosciences）和FITC Annexin V凋亡检测试剂盒（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）检测细胞凋亡。

丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）活性测定

使用Abcam的试剂盒（ab105134、ab105135）测定ALT和AST活性。

统计分析

GraphPad Prism软件（美国加利福尼亚州拉荷拉）用于分析数据。连续变量报告为平均值±标准差（SD），并使用Student t检验（两组数据）或单向方差分析，然后使用Tukey-s检验进行事后两两比较。统计学意义设为P<0.05。

结果

脓毒症患者血清VDBP、25(OH)D3和1,25(OH)2D3低于健康对照组

与健康对照组相比，脓毒症存活者组血清VDBP、25(OH)D3和1,25(OH)2D3水平显著降低，[VDBP: (418.06 ± 64.26) μg/ml vs (295.20 ± 52.90) μg/ml, P < 0.001; 25(OH)D3: (112.30 ± 23.70) nmol/L vs (26.20 ± 12.70) nmol/L, P < 0.001; 1,25(OH)2D3: (21,706.50 ± 3331.60) fmol/L vs (8106.00 ± 2952.10) fmol/L, P < 0.001]。脓毒症非存活者组[VDBP: (418.06 ± 64.26) vs (178.10 ± 30.60) μg/ml, P < 0.001]。25(OH)D3: (112.30 ± 23.70) nmol/L vs (19.60 ± 12.60) nmol/L, P < 0.001; 1,25(OH)2D3: (21,706.50 ± 3331.60) fmol/L vs (5852.70 ± 1040.40) fmol/L, P < 0.001] (图. 1a–c)。脓毒症存活者组的血清VDBP、25(OH)D3和1,25(OH)2D3水平高于脓毒症非存活者组[VDBP: (295.20 ± 52.90) μg/ml vs (178.10 ± 30.60) μg/ml, P < 0.001; 25(OH)D3:  (26.20 ± 12.70) nmol/L vs. (19.60 ± 12.60) nmol/L, P = 0.0338; 1,25(OH)2D3: (8106.00 ± 2952.10) fmol/L vs (5852.70 ± 1040.40) fmol/L, P = 0.0013] (图. 1a–c)。脓毒症患者的相关分析显示，VDBP升高与25(OH)D3血清水平升高有关（r=0.609，P<0.001），但与1,25(OH)2D3水平无关（r=0.1485，P=0.194）（图1d，e）。脓毒症患者血清1,25(OH)2D3与25(OH)D3不相关（r=-0.1087，P=0.344）（图1f）。表1显示了存活[脓毒症（s），n=43]组与非存活[脓毒症（d），n=35]组脓毒症患者的人口统计学和临床特征。

低VDBP水平与疾病严重程度和轻微肝损伤的相关性

脓毒症的严重程度通过急性生理与慢性健康评估（APACHE）II和SOFA评分进行评估，并考虑其与脓毒症患者住院死亡率的独立相关性。在脓毒症患者中，较低的血清VDBP水平与更严重的疾病相关，如较高的APACHE II评分（r=− 0.2565，P=0.0234）和SOFA评分（r=− 0.3522，P=0.0016）（图2a，b）。较低的血清VDBP水平与较低的白蛋白（ALB；r=0.4628，P<0.001，图2c）和总蛋白（TP；r=0.263，P=0.02，图2d）相关。

图1.脓毒症患者血清VDBP、1,25(OH)2D3与25(OH)D3水平显著下调。

a–c使用相应的ELISA试剂盒测量健康志愿者组（NC，n=50）、脓毒症非存活者组[脓毒症（d），n=35]和脓毒症存活者组[败血症（s），n=43]中VDBP、1,25(OH)2D3与25(OH)D3的血清水平。与健康志愿者组相比，***P<0.001；与脓毒症存活者组相比，#P<0.05、#P<0.01和##P<0.001。d–f VDBP与1,25(OH)2D3（P>0.05）、VDBP与25(OH)D3（P<0.001）或1,25(OH)2D3与25(OH)D3（P>0.05）之间的相关性。VDBP：维生素D结合蛋白。

CLP小鼠血清VDBP的时间分布

从术后12小时开始，CLP组小鼠显示出脓毒症的迹象，包括嗜睡和发烧。血清VDBP在第1天开始下降，第5天达到最低点，第7天恢复到基线水平(图3a)。血清IL-6(图3b)和TNF-α(图3c)均在第1天达到峰值。在CLP组中，只有30%的小鼠存活超过第5天(图3d)。

CLP小鼠肝脏VDBP的低表达

HE染色显示CLP小鼠(图4a)严重的肝损伤(如血管破裂、出血、肝细胞水肿、肝细胞分布和肝窦结构异常)和炎细胞浸润。与血清VDBP的时间模式相似，肝损害的程度在第5天达到稳定(图4a)。IHC试验显示CLP小鼠肝组织中VDBP水平低于假小鼠(P<0.001,图4b)。CLP小鼠肝脏VDBP水平在第3天最低，然后逐渐升高，接近基线(图4b)。

LPS作用于Thle2细胞的实验研究

LPS降低THLE2肝细胞活力呈时间依赖性(图5a)。在10～10μg/ml(图5b)范围内，LPS的作用也呈浓度依赖性。随后使用1μg/ml LPS 24小时的实验显示VDBP mRNA减少(P<0.001)，蛋白质减少，上清液中的分泌减少(P<0.001，图5c)。LPS暴露除了降低细胞活力(P<0.001)外，还增加了凋亡细胞率、Caspase-3活性(P<0.001)、Caspase-9活性(P<0.001)(图5d)、上清液ALT(P<0.001)和AST(P<0.001)水平(图5e)。提示LPS诱导的肝细胞损伤模型已成功建立。LPS处理后(图5f)可提高MPO活性和MDA水平(P<0.001),降低GSH水平(P<0.001)。

图2. VDBP水平与疾病严重程度和肝损伤的关系。

a,b败血症患者血清VDBP水平与APACHEⅡ(P<0.05)或SOFA评分(P<0.01)的相关性分析(n=78)。c,d败血症患者血清VDBP水平与ALB(P<0.001)或TP水平(P<0.05)的双变量相关分析(n=78)。ALB：白蛋白、APACHEII：急性生理和慢性健康评估、SOFA：序贯器官衰竭评估、TP：总蛋白、VDBP：维生素D结合蛋白

图3.假小鼠和CLP小鼠血清中VDBP和炎症因子的表达分析。

小鼠(n=40)随机分为假手术组(n=20)和CLP组(n=20)。假手术组和CLP组在术后第1、3、5、7天各取5只小鼠。a 用小鼠VDBP ELISA试剂盒检测SHAM和CLP小鼠手术后第0、1、3、5、7天血清VDBP水平。b，c 用小鼠IL-6和TNF-αELISA试剂盒分别检测SHAM和CLP小鼠手术后第0、1、3、5、7天血清IL-6和TNF-α水平。d SHAM和CLP小鼠存活率。与假手术组比较，**P<0.01和***P<0.001。CLP：盲肠结扎穿刺术、IL-6：白细胞介素6、TNF-α：肿瘤坏死因子α、VDBP：维生素D结合蛋白

使用慢病毒载体的VDBP过表达减弱了LPS暴露对细胞活性(P=0.0239)、细胞凋亡、caspase-3活性(P =0.0115)和caspase-9活性(P=0.0159)的影响（图5d）。VDBP表达也显著降低了LPS诱导的ALT(P=0.0098)和AST(P =0.0013)释放（图5e）。VDBP过表达还减弱了LPS暴露对MPO活性(P =0.0045)、MDA水平(P<0.001) 和GSH水平(P =0.0043)的影响（图5F）。LPS暴露导致THLE2细胞中p-JNK蛋白水平显著增加，VDBP过表达抑制了这种反应（图5g）。 

图4.CLP小鼠和假小鼠肝组织的肝脏病理学分析和VDBP表达分析。

a假小鼠和CLP小鼠术后第1、3、5、7天肝组织HE染色分析，黑色箭头：出血；红色箭头：水肿和肝窦结构异常；蓝色箭头：炎症细胞浸润。b手术后第 1、3、5 和 7 天假小鼠和 CLP 小鼠肝组织中的 VDBP IHC 分析。与假手术组相比，***P  < 0.001。CLP：盲肠结扎和穿刺、HE：苏木精-伊红、IHC：免疫组化、VDBP：维生素D结合蛋白、IOD：综合光密度。

图5.VDBP过表达减弱了LPS诱导的THLE2肝细胞损伤。

a THLE2细胞用1μg/ml LPS处理，在LPS刺激后0、6、12、24和48小时，通过MTT测定评估细胞活力，与0 h组相比，***  P<0.001。b 用不同浓度的LPS刺激THLE2细胞24小时，然后通过MTT法测定细胞活力，与0 ng/ml组相比， *  P<0.05和 *** P<0.001。c 用或不用1μg/ml LPS处理THLE2细胞24小时，分别通过RT-qPCR和蛋白质印迹法测量VDBP mRNA和蛋白质表达水平，使用商业试剂盒检测VDBP分泌水平，与对照组相比，***  P<0.001。d-f 编码人VDBP（LV-VDBP）和对照（LV-NC）的重组慢病毒感染的THLE2细胞用1μg/ml LPS处理24小时，随后检测细胞活力、细胞凋亡率、caspase-3活性、caspase-9活性、ALT、AST、MPO 活性、MDA水平和GSH水平，与对照组相比，  ***  P<0.001；与 LPS + LV-NC 组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P <0.001。g 用LV-NC或LV-VDBP感染的THLE2细胞用1μg/ml LPS 处理24小时。p-JNK和JNK的蛋白质水平通过蛋白质印迹法测定。ALT ：丙氨酸氨基转移酶、AST ：天冬氨酸转氨酶、GSH ：谷胱甘肽、JNK： c-Jun N 末端激酶、LPS ：脂多糖、MDA：丙二醛、MPO：髓过氧化物酶、p-JNK：磷酸化 JNK、VDBP：维生素 D 结合蛋白。

讨论

维生素 D (VitD) 参与多种生物过程，包括骨代谢、免疫调节、炎症反应和细胞增殖。VitD 缺乏与多种疾病有关，包括心血管疾病、自身免疫性疾病和传染病。例如，大多数烧伤和危重病人都缺乏 VitD，低水平的 VitD 与严重烧伤和危重症的不良愈后（例如脓毒症、器官衰竭和死亡）相关。VitD 在肝脏中首先代谢为 25(OH)D3，然后在肾脏转化为具有活性的1,25(OH)2D3。以前的研究表明，脓毒症患者的VitD缺乏的发生率较高，且VitD缺乏的患者脓毒症风险和预后较差。最近的一份关于严重强直性脊柱炎患者对VitD没有反应的病例报告显示严重的VDBP缺乏，因此，由于GC基因的纯合缺失，VitD 反应性 CYP24A1 和 VitD 代谢物如 25(OH)D3和1,25(OH)2D3显著减少。

与之前的研究类似，目前的研究表明，与健康对照相比，脓毒症患者的血清 VDBP 以及 25(OH)D3和 1,25(OH)2D3的血清水平更低。事实上，低 25(OH)D3血浆水平已被证明是脓毒症的风险。此外，与之前的研究类似，我们还发现存活时间未超过 28 天的脓毒症患者的VDBP 、25(OH)D3和 1,25(OH)2D3血清水平低于存活者。

器官衰竭，尤其是肝衰竭，与脓毒症患者的不良预后有关。已发现急性肝功能衰竭或慢性乙型肝炎患者的 VDBP 血清水平显著降低。一些研究还报道了肝纤维化患者血清VDBP水平较低以及VBP降低幅度与纤维化程度之间的关联。之前对接受肝移植的患者进行的一项研究发现血清VDBP存在双相变化：最初下降，然后恢复到接近正常水平。总之，这些发现表明VDBP在肝损伤和再生中的作用。在目前的研究中，较低的血清VDBP水平与脓毒症患者肝功能指标（ALB和TP）的异常相关，表明VDBP水平的改变与肝功能障碍有关。

本研究中的CLP小鼠实验显示，在术后的前5天，VDBP的血清水平降低，随后在第7天恢复到接近正常的水平。此外发现CLP小鼠肝脏中VDBP的表达降低。血清IL-6和TNF-α水平在第1天达到峰值。炎症反应对损伤的反应迅速，因此，IL-6和TNF-α水平在损伤后立即升高。促炎细胞因子的过度释放会进一步加重器官损伤。先前的研究还表明，循环系统中的VDBP浓度与器官功能障碍和创伤后脓毒症有关。本研究中，术后第5天在腹腔、肠道和肝脏中观察到一些脓肿，这表明在损伤后第5天器官损伤是严重的。因此，血清VDBP水平显著降低的时间点与IL-6和TNF-α水平升高的时间点不同。

脓毒症中器官衰竭的发展被认为与氧化应激介导的损伤密切相关。据报道，在脓毒症的CLP模型中，芝麻酚可降低肝脏氧化应激并减轻肝脏损伤。在培养的THLE2细胞中，LPS暴露后VDBP的表达和分泌水平显著降低。使用慢病毒载体过度表达VDBP减少了LPS诱导的损伤和LPS介导的氧化应激。JNK信号通路与多种生物活动有关，包括细胞存活、凋亡和对细胞内和细胞外应激(如氧化应激和炎症应激)的反应。已证明通过使JNK信号通路失活来减少LPS诱导的肝损伤。例如，葛根素已被证明可以通过抑制JNK信号通路来减少脂多糖诱导的肝损伤。用川陈皮素抑制JNK途径可保护肝组织和培养的肝细胞免受炎症刺激诱导的急性损伤。本研究中VDBP过表达导致氧化应激降低和JNK信号通路失活，表明JNK通路参与脓毒症诱导的肝损伤。

结论

总之，目前的研究证实脓毒症患者血清VDBP水平低于健康对照组。我们还发现，存活时间不超过28天的脓毒症患者血清VDPB水平低于存活者。VDBP血清水平较低的脓毒症患者具有较低的ALB和TP，以及较高的APCHE II和SOFA评分，表明VDBP水平与脓毒症疾病严重程度呈负相关。脓毒症小鼠和LPS诱导的受损肝细胞中的VDBP水平降低。VDBP过度表达减轻了LPS诱导的肝细胞损伤，这与氧化应激的减少和JNK信号通路的失活有关。我们的实验方法是初步的，需要更多的研究来证实我们的发现。动物实验需要研究VDBP过度表达或基因敲除对肝损伤和脓毒症结果的影响，以及相关的分子过程。

评述：

脓毒症被定义为宿主对感染的反应失调导致的危及生命的器官功能障碍。尽管现代医学取得了重大进展，但仍然缺乏有针对性的药物干预来治疗和改善脓毒症预后。目前已有许多研究证实维生素D对脓毒症的发生发展具有保护作用，但其作用机制尚不清楚。本研究通过检测脓毒症患者、脓毒症小鼠模型和暴露于脂多糖(LPS)培养的肝上皮细胞系中血清VDBP水平与肝损伤之间的关系，得出VDBP过度表达减轻了LPS诱导的肝细胞损伤，这与氧化应激的减少和JNK信号通路的失活有关。其为研究维生素D对脓毒症的保护机制提供了方向，但这一研究结论的得出，仍需大量基础实验来证实。

翻译：喇宏玲、马琳

审校：王洋 

述评：苏涛

原始文献：   Xiao Kun,Zhang Du-Chao,Hu Ye,et al.Potential roles of vitamin D binding protein in attenuating liver injury in sepsis.Military Medical Research.2022;9 (1)：4.doi:10.1186/s40779-022-00365-4  

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