科研丨曲阜师大: 高海拔驱动有蹄类动物肠道菌群α多样性和指示菌群的趋同进化(国人佳作)

编译：微科盟北岸，编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读  

趋同进化是进化生物学的一个重要领域。高海拔环境是动物生存的极端环境之一，特别是在青藏高原，这促使人们探索在更广泛的系统发育下，高海拔因素是否驱动了偶蹄目和奇蹄目动物肠道菌群趋同进化。因此，研究人员使用16S rRNA基因测序分析了高海拔和低海拔偶蹄目和奇蹄目动物的肠道微生物组。聚类分析表明，高海拔偶蹄目和奇蹄目的肠道微生物组组成没有分组在一起，并且与低海拔偶蹄目和奇蹄目的肠道菌群组成存在较大差异。基于Wilcoxon检验，高海拔有蹄类动物的Sobs和Shannon指数显著高于低海拔有蹄类动物。在门分类水平上，厚壁菌门和Patescibacteria在高海拔有蹄类动物的肠道菌群中显著富集，Firmicutes/Bacteroidetes值也高于低海拔有蹄类动物。在科分类水平上，Ruminococcaceae、Christensenellaceae和Sacchharimonadaceae在高海拔有蹄类动物的肠道微生物组中显著富集。研究结果还表明，OH组和FH组共享两个显著丰富的菌属，Christensenellaceae_R_7_group和Candidatus_Saccharimonas。上述结果表明，高海拔不能超过目分类水平驱动有蹄类动物肠道菌群组成趋同进化，但可以驱动有蹄类动物肠道微生物组α多样性和指示菌群的趋同进化。总体而言，本研究为理解有蹄类动物对高海拔环境的适应性提供了一个新的视角。  

论文ID

原名：High-Altitude Drives the Convergent Evolution of Alpha Diversity and Indicator Microbiota in the Gut Microbiomes of Ungulates

译名：高海拔驱动有蹄类动物肠道菌群α多样性和指示菌群的趋同进化

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：6.064

发表时间：2022.7

通讯作者：张洪海

通讯作者单位：曲阜师范大学生命科学学院

DOI号：10.3389/fmicb.2022.953234

实验设计

结果

1 测序数据概述

研究人员从41个样本中获得了4,374,777条有效tags，每个样本平均有106,702条有效tags。在97%相似性标准阈值下，样本HA-9在所有样本中OTU数量最多(2,560个OTU)，而样本HT-1 OTU数量最少(1,161个OUT；补充表S3，Sobs)。其他α多样性指数在补充表S3(包括Chao1、Simpson、Shannon和Good’s coverages)。物种积累箱线图和41条稀疏曲线逐渐平缓，表明样品数量和测序深度满足后续实验分析(图1)。此外，每个样本的Good’s coverages指数高于95%，这也表明样本中的细菌群落有效地代表了有蹄类动物肠道中的细菌群落。

图1 物种积累箱线图(A)和稀疏曲线(B)。在物种累积箱线图中，横坐标是样本量，纵坐标是观察到的物种数量。在稀疏曲线中，横坐标是从样本中随机选取的测序样本数，纵坐标是OTUs数量(Sobs)。

2 聚类分析

由于野生和圈养有蹄类动物的食物组成不同，研究人员添加了岩羊(B组)和欧洲盘羊(M组)的已发表数据(从西宁野生动物园采集的样本)纳入聚类分析中，以消除食性的影响。西宁野生动物园的有蹄类动物的食性与济南野生动物园和济南动物园的饮食大致相同(补充表S4，Sun等人在2019年发布的样本信息)。基于门分类水平的相对丰度和Bray-Curtis距离，研究人员选择了丰度前10的菌门生成UPGMA树(图2)。偶蹄目(HT、HB、HY、M、B、LB和LY组)分组在一起，奇蹄目(组HA和LA组)的物种被聚类到另一个分支中。偶蹄目和奇蹄目在高海拔和低海拔分别分为两支。PCoA(图3)和NMDS分析(stress = 0.051，图4)还表明偶蹄目动物的肠道菌群与奇蹄目动物的肠道菌群组成不同，高海拔偶蹄目(HT，HB，HY，M和B组)和奇蹄目(HA组)动物的肠道菌群组成与低海拔偶蹄目(LB和LY组)和奇蹄目(LA组)动物的肠道菌群组成有很大差异。这些结果表明，高海拔地区不能超过目分类水平，驱动有蹄类动物肠道菌群组成趋同。并且，研究人员消除了野生和圈养有蹄类动物之间的食性组成影响。因此，研究人员发现HT、HB、HY、M和B组肠道菌群组成的相似性高于LB、LY和LA组。这意味着主要影响因素是海拔和系统发育，而不是食性。因此，基于这两个影响因素，研究人员将高海拔偶蹄目(HT，HB和HY组)、高海拔奇蹄目(HA组)、低海拔偶蹄目(LB和LY组)和低海拔奇蹄目(LA组)分别归类为FH、OH、FL和OL组。

ANOSIM分析表明，OH组和OL组(R = 0.9695，p = 0.001)以及FH和FL组(R = 0.7028，p = 0.001)的肠道菌群组成的未加权uniFrac距离具有显著性差异。这表明，这些分组的划分是合理的。

图2 聚类分析基于Bray–Curtis距离。UPGMA树基于前10优势菌门丰度绘制。

图3 肠道菌群组成的主坐标分析(PCoA)。每个符号代表一个群体的肠道微生物组。HA，高海拔藏野驴；HB，高海拔岩羊；HT，高海拔藏羚羊；HY，高海拔牦牛；LA，低海拔藏野驴；LB，低海拔岩羊；LY，低海拔牦牛。B，西宁野生动物园的岩羊，M，西宁野生动物园的欧洲盘羊。

图4 肠道菌群组成的NMDS分析。每个符号代表一个群体的肠道微生物组。HA，高海拔藏野驴；HB，高海拔岩羊；HT，高海拔藏羚羊；HY，高海拔牦牛；LA，低海拔藏野驴；LB，低海拔岩羊；LY，低海拔牦牛。B，西宁野生动物园的岩羊，M，西宁野生动物园的欧洲盘羊。

3 肠道菌群组成

在偶蹄目和奇蹄目动物的肠道菌群中共检测到25个门，49个纲，99个目，170个科，366个属和136个物种。

在门水平(丰度排名前五的菌门)，厚壁菌门(F)和拟杆菌门(B)是FH组(F，53.77%；B，20.57%)、FL组(F，45.48%；B，18.92%)、OH组(F，43.71%；B，31.35%)和OL组(F，38.98%；B，41.5%)的主要优势菌门。FH组其他优势菌门为放线菌门(7.99%)、Euryarchaeota(5.27%)和疣微菌门；FL组其他优势菌门为变形菌门(30.46%)、放线菌门(2.41%)和Spirochaetes(0.72%)；OH组其他优势菌门为Kiritimateiellaeota(6.79%)、Spirochaetes(5.62%)和Patescibacteria(3.68%)；OL组其他优势菌门为Spirochaetes(6.71%)、变形菌门(5.39%)和Kiritimatiellaeota(3.28%)(图5A)。

在科分类水平上，丰度排名前10位的菌科占四组总丰度的59.26%以上(FH：69.19%；FL：82.74%；OH：59.26%和OL：66.72%)。在这10个菌科中，Ruminococcaceae在FH(29.98%)和OH(19.38%)组中丰度最高。Moraxellaceae(27.49%)在FL组中丰度最高，F082(16.81%)在OL组中丰度最高(图5B)。此外，在属分类水平上，Ruminococcaceae_UCG-005(9.44%)是FH组中丰度最高的菌属，Acinetobacter(27.39%)是FL组中丰度最高的菌属，而Rikenellaceae_RC9_gut_group是OH组(7.63%)和OL组(7.70%)中丰度最高的菌属(图5C)。

图5 有蹄类动物在门(A)、科(B)和属(C)分类水平上肠道菌群组成。FH组，高海拔偶蹄目(包括HB，HT和HY组)；FL组，低海拔偶蹄目(包括LB和LY组)；OH组，高海拔奇蹄目(HA组)；OL组，低海拔奇蹄目(LA组)。

4 组间差异分析

Sobs(FH组 vs. FL组, p = 0.003；OH组 vs. OL组, p = 0.003)和Shannon(FH组 vs. FL组，p = 0.001；OH组vs. OL组，p = 0.008)指数的Wilcoxon’s检验组间差异于箱图中展示(图6)。FH组和OH组的肠道微生物组多样性和丰富度均显著高于低海拔组(FL和OL)。

研究人员使用LEfSe分析(LDA> 4，p < 0.05)来确定各组(FH和FL组以及OH和OL组)之间的指示微生物群(生物标志物)。在门分类水平上，厚壁菌门和Patescibacteria在FH和OH组中显著富集。疣微菌门和Euryarchaeota在FH组中显著丰富。同时，OH组的Kiritimatiellaeota比OL组丰度更高，FL组和OL组中的共享生物标志物为变形菌门，OL组的拟杆菌门比OH组丰度更高(图7)。

在科分类水平上，Ruminococcaceae、Christensenellaceae和Sacchamonadaceae在FH和OH组中显著富集；Akkermansiaceae、Lachnospiraceae、FamilyXIII和Methanobacteriaceae在FH组中显著富集。Moraxellaceae在FL组和OL组中显着富集；Planococcaceae和Enterobacteriaceae在FL组中丰度高于FH组；F082在OL组中丰度高于OH组(图7)。在属分类水平上，FH组和OH组的Christensenellaceae_R_7_group和Candidatus_Saccharimonas显著富集。此外，Ruminococcaceae_UCG-013，Ruminococcaceae_UCG-005、Methanobrevibacter和Akkermansia在FH组中丰度显著高于FL组。我们的研究结果还表明，Escherichia_Shiella、Acinetobacter、Solibacillus和Planococcus在FL组中丰度显著高于FH组，Acinetobacter在OL组中比在OH组中更丰富(图7)。

Wilcoxon检验用于各组之间的Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)值的差异。附图S1显示，高海拔组(FH和OH)的F/B值高于低海拔组(FL和OL; FH组vs. FL组，p > 0.05)，OH组的F/B值显著高于OL组(p < 0.01)。

图6 使用Wilcoxon对组间肠道微生物组的α多样性(Sobs和Shannon指数)进行检验。(A)FH组与FL组的Sobs指数；(B) OH组与OL组的Sobs指数；(C) FH组与FL组的Shannon指数；(D) OH组与OL组的Shannon指数。FH，高海拔偶蹄目(包括HB，HT和HY组)；FL，低海拔偶蹄目(包括LB和LY组)；OH，高海拔奇蹄目(HA组)；OL，低海拔奇蹄目(LA组)。

图7 LEfSe分析不同海拔高度之间有蹄类动物的指示菌群。(A) FH组，(高海拔偶蹄目，包括HB，HT和HY组)与FL组(低海拔偶蹄目，包括LB和LY组)；(B) OH组(高海拔奇蹄目，HA组)与OL组(低海拔奇蹄目，LA组)。

讨论

肠道微生物组对于宿主适应各种因素的能力很重要，包括温度，生态位和食性，可以提供能量和营养，并维持宿主的肠道稳态。许多学者通过肠道微生物组研究了动物对高海拔的适应机制，特别是有蹄类动物。然而，在以前的研究中，系统发育对其肠道微生物组组成几乎没有影响，因为有蹄类动物的系统发育在科、亚科和属分类水平上影响有限。因此，在更广泛的系统发育下，本研究探讨了驱动不同海拔地区有蹄类动物肠道微生物组趋同进化的因素。

使用16S rRNA高通量测序，表征了不同海拔地区有蹄类动物的肠道菌群组成。在门分类水平上，厚壁菌门和拟杆菌门是所有样品中的主要菌门(图5)。这些结果与有蹄类动物的其他动物肠道微生物组成一致，例如藏野驴、牦牛、藏羚羊和盘羊。

基于UPGMA树，研究人员发现HA、HB、HT和HY组没有聚集在同一分支中，而偶蹄目(组HB、HT、HY、LY、M、B和LB)聚集在一起。具有密切系统发育关系的有蹄类动物具有相似的肠道微生物组组成。这些结果表明，高海拔地区不能超过目分类水平驱动有蹄类动物肠道菌群相对丰度组成趋同进化。系统发育是影响物种肠道微生物组组成的主要因素之一；例如，对59种新热带鸟类的研究发现，系统发育因子解释了大部分差异。在不同的生态位中，具有密切系统发育关系的非灵长类动物具有相似的肠道微生物组组成。此外，在高海拔或低海拔地区，偶蹄目和奇蹄目动物的肠道菌群组成不同，PCoA和NMDS显示HB、HT、HY、M和B组聚集在一起。这表明高海拔在目分类水平上驱动了有蹄类动物肠道菌群组成趋同进化。海拔高度是影响有蹄类动物相对微生物组组成的主要因素之一。这是因为，即使西宁野生动物园组(M组和B组)和FL组的食性组成相似，但它们并没有聚在一起。

在Wilcoxon对Sobs和Shannon的检验中，高海拔组(OH和FH)显著高于低海拔组(FL和OL)。较高的肠道细菌多样性和丰富度通常与健康和稳定的宿主肠道微生物组相关。高海拔驱动偶蹄目和奇蹄目动物的肠道微生物组产生相同的α多样性模式。

在这项研究中，OH和FH组含有大量厚壁菌门，它们可以分解纤维和纤维素为宿主提供挥发性脂肪酸。此外，高海拔组的F/B值与低海拔组相比呈上升趋势。较高的F/B值表明宿主具有较大的体型和脂肪。许多研究人员发现，高海拔有蹄类胃肠道微生物组的F/B值显著高于低海拔有蹄类动物。较高的F/B比值有利于高海拔有蹄类动物的能量收集。OH组和FH组的Patescibacteria的相对丰度高于OL和FL组。硝酸还原酶(EC 1.7.99.4)积极预测Patescibacteria中的亚硝酸盐还原酶(NO形成，EC 1.7.2.1)和一氧化氮还原酶(细胞色素c，EC 1.7.2.5)，对反硝化具有协同作用。反硝化细菌可以减少牛瘤胃液体中的甲烷气体产生，因为甲烷是产甲烷古菌的瘤胃发酵副产物，导致能量损失。Patescibacteria可以减少有蹄类动物在高海拔环境中的能量损失。

FH组的疣微菌门和Euryarchaeota相对丰度显著高于FL组。疣微菌门存在于健康个体的肠粘膜中，具有抗炎作用，同时维持宿主微生物组中的葡萄糖稳态。Euryarchaeota可以促进碳水化合物发酵以产生短链脂肪酸，其在肠道生态系统中起重要作用。Kiritimatiellaeota是马和野生狮尾狒后肠中的主要微生物群，也存在于绵羊和牛的瘤胃中。研究人员推测，Kiritimatiellaeota在食草物种的消化中起着重要作用，这需要进一步的功能验证。

Ruminococcaceae、Christensenellaceae和Sacchamonadaceae的丰度在OH和FH组显著增加。Ruminococcaceae和Christensenellaceae是OH和FH组中丰度排名前10的菌科。Ruminococcaceae与纤维素和淀粉的分解有关，并且可以产生乙酸和甲酸。Christensenellaceae是一种有效的糖发酵科，可以将葡萄糖分解成乙酸和丁酸，并且可以分解纤维素。同时，Saccharimonadaceae与免疫反应有关。FamilyXIII与肠道健康的维持有关，Lachnospiraceae含有几种纤维素溶解/纤维化属，其丰度在FH组中增加，这有利于在极端环境中获得能量并维持宿主的体内平衡。

OH和FH组共享两个选择丰富的菌属，Christensenellaceae_R_7_group和Candidatus_Saccharimonas。Christensenellaceae_R_7_group的功能与Christensenellaceae的功能相同。此外，Candidatus_Saccharimonas物种与丙酸和丁酸水平呈正相关，并且在维持肠道功能方面起重要作用。Akkermansia属的相对丰度在FH组中高于其他组。以前的研究表明，Akkermansia可以巩固肠道屏障并调节免疫功能。因此，显著富集的菌属可以帮助高海拔有蹄类动物应对极端环境。

基于上述结果，高海拔有蹄类动物中显著富集的微生物群在分解膳食纤维和纤维素、获取能量、维持肠道稳态等方面起着重要作用。高海拔因子不能超过系统发育来驱动有蹄类动物肠道菌群组成的趋同进化，高海拔因子驱动高海拔地区偶蹄目和奇蹄目肠道微生物组中α多样性和指示微生物群的趋同进化。然而，考虑到16S rRNA测序技术的局限性，研究人员对富集微生物群和物种水平的理解仍然有限。因此，在未来的研究中，有必要全面采用宏基因组学和代谢组学来阐明富集微生物群的组成和功能，特别是在不同海拔的有蹄类动物肠道菌群的菌种分类水平上。