肿瘤免疫治疗的最理想靶标：新抗原 道阻且长 未来可期

癌症免疫治疗有效的基本前提是肿瘤内存在功能性、抗原特异性T细胞。新抗原作为免疫治疗的理想靶标，是一种有前景的治疗选择。肿瘤新抗原（Neoantigen)是由肿瘤细胞突变基因编码的新生抗原，主要由基因点突变、删除突变、基因融合等产生的与正常细胞表达的蛋白不一样的新的异常蛋白。这些蛋白经过酶解之后形成的多肽片段，作为抗原递呈给T细胞，可促使T细胞变为特异性地识别肿瘤新抗原的成熟活化T细胞，并使这些活化的T细胞数量增殖。新抗原治疗仍有许多问题需要解决，比如抗原筛选的准确性、肿瘤异质性等。

2022年11月，比利时Lybaert教授等在Cancer Cell上发表了一篇Challenges in neoantigen-directed therapeutics的综述文章，系统阐述了新抗原的准确预测和亟待解决的临床问题，以最大限度发挥新抗原免疫治疗的价值。

临床挑战

理论上新抗原免疫治疗前景广阔，但迄今尚未获监管部门批准。

-主要原因在于新抗原的抗肿瘤活性，如特异性抗原的准确筛选、临床试验方案设计不合理以及未考虑肿瘤异质性等。

-另一方面，由于晚期癌症的免疫抑制，过继细胞疗法在实体瘤中治疗应答低。

-此外，实体瘤复杂的免疫抑制微环境，导致免疫逃逸。

肿瘤异质性

近年来，肿瘤免疫微环境在癌症进展和治疗应答中的重要角色，再次强调了识别肿瘤免疫图谱的重要性。免疫检查点抑制剂用于不同癌种治疗未达到预期疗效，常与肿瘤免疫异质性相关。一些患者可从免疫治疗中获益，而另一些患者——即便患有同种癌症——却没有治疗应答。每个肿瘤都有其独特的免疫图谱，以逃避抗肿瘤免疫应答。已经定义了三种“免疫类型”-免疫炎症型、免疫豁免型和免疫沙漠型。

联合治疗

大多数肿瘤免疫检查点抑制剂单药治疗抗肿瘤活性低，通过联合治疗，尤其是含新抗原的免疫联合治疗，可从多个维度杀伤癌细胞。此外，治疗过程中纵向评估同样重要，可及早发现耐药并调整治疗方案。

-炎症性肿瘤：新抗原与免疫检查点抑制剂联合治疗

炎症性肿瘤微环境免疫原性高，微环境中存在大量免疫细胞浸润。然而，肿瘤免疫逃逸限制了免疫细胞活性。考虑到新抗原的有效抗肿瘤免疫反应，新抗原与免疫检查点抑制剂联合治疗具有重要的临床价值。

与免疫检查点抑制剂联合，最终可产生扩大的肿瘤反应性T细胞库，可识别新抗原提呈癌细胞。由新抗原免疫治疗或过继细胞疗法产生的新抗原特异性、肿瘤浸润性T细胞，也可以刺激免疫微环境中IFN-ɣ的产生。

相关临床研究已显示该联合治疗的效果和潜力，黑色素瘤中新抗原与免疫检查点抑制剂联合、乳腺癌中TIL-ACT癌症疫苗与帕博利珠单抗联合。这些临床案例中，一旦新抗原特异性T细胞进入免疫抑制性微环境，就能够发挥功能。

-免疫豁免型肿瘤：新抗原与抗血管生成治疗联合

免疫豁免型肿瘤细胞周围存在大量免疫细胞，但因间质致密，免疫细胞不能渗透到肿瘤细胞内，而是限制在肿瘤细胞的外围基质。因此，新抗原或免疫检查点抑制剂治疗，诱导或重新激活的新抗原特异性T细胞不能到达肿瘤区域。新抗原治疗与抗血管治疗联合，增加免疫细胞浸润，改善预后。

免疫豁免型肿瘤中，免疫检查点抑制剂联合抗血管治疗显著提升临床获益，在肾细胞癌和肝细胞癌中已取得积极治疗效果。

-免疫沙漠型肿瘤：新抗原联合免疫原性细胞死亡（ICD）治疗

确定免疫沙漠型肿瘤的有效治疗方案至关重要，因其免疫治疗选择有限。免疫原性细胞死亡（ICD）治疗是目前正在探索的策略之一。放疗、化疗和溶瘤病毒治疗均可引起ICD，释放新抗原，包括癌症抗原、受损蛋白、损伤相关分子模式和促炎细胞因子，这些因子吸引并触发免疫系统对抗癌细胞，由非免疫原性转变为免疫原性，促使机体产生抗肿瘤免疫应答。

特异性新抗原鉴定

随着新技术和检测方法的进步，越来越多的工具用于评估外周血和肿瘤中疫苗应答效果。

▲外周血和肿瘤中的新抗原诱导免疫应答评估

-外周血免疫应答评估

酶联免疫斑点技术（ELISPOT）、流式胞内染色、MHC多聚体实验，广泛用于评估疫苗诱导的T细胞反应持续时间、频率、表型和功能。

IFN-ɣ ELISPOT是评估免疫效果的重要手段，评估疫苗诱导的T细胞激活状态和细胞毒性。

TCR测序也可以评估T细胞克隆的定量变化。

免疫基因组工具，包括单细胞TCR测序和单细胞RNA-seq（scRNA-seq），可在克隆水平解析疫苗特异性T细胞，并可以提供细胞的表型和功能的高分辨率信息。然而，目前确认单个TCR对疫苗新表位的特异性仍然很复杂。

-肿瘤组织免疫评估

免疫治疗后肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和其他免疫细胞群可提示新抗原疫苗是否有效。

多色免疫组化和免疫荧光可全面表征肿瘤免疫浸润，并提供FFPE样本的空间分辨信息。

免疫治疗前新鲜或新鲜冷冻的肿瘤活检组织使用配对scTCR-seq可以评估TILs的TCR克隆型频率的变化，监测单个克隆的动态变化。

scRNA-seq可提供单个TCR克隆型的T细胞状态和功能信息。

生物信息的挑战

有效的新抗原需满足如下条件：

-首先，必须具有肿瘤特异性，防止脱靶效应影响患者健康组织。

-其次，需呈递到肿瘤细胞表面，以使免疫细胞识别并杀伤肿瘤细胞。

-最后，有效的新抗原必须能够激活免疫应答——也就是说，需要具有免疫原性。

从海量的肿瘤肽中筛选新抗原并不简单，需考虑多种因素，如患者的人类白细胞抗原（HLA）类型、肿瘤细胞异质性和与肽加工相关的信息。

当前标准的新抗原预测路径

标准的新抗原预测包括四步：

-原始测序数据预处理，HLA分型。

-基因组比对和变异检测。

-MHC结合和呈递新抗原预测。

-新抗原的优先级排序和选择。

随着新一代测序成本持续下降，可对正常和肿瘤组织分别进行全外显子测序（WES）或全基因组测序（WGS），更敏感并更可靠地识别变异成本却更高。WGS可更可靠地筛选更多潜在新抗原，如基因融合和染色体重排、拷贝数变异。

-HLA分型

新抗原必须与MHC分子结合并呈递，以诱导T细胞应答。HLA基因具有高度多态性和患者特异性。因此，新抗原预测依赖于HLA分型的准确性，大多数集中于MHCI类（MHC-I）预测，尽管MHCII类（MHC-II）预测也很重要，但目前并不常见。

总的来说， HLA-I分型的大多数软件性能较好。常用的软件包括OptiType和PolySolver，准确度超过95%的其他软件，包括HISAT-genotype、HLA*PRG、HLA-HD、HLA-LA和xHLA。RNA-seq数据也可用于HLA分型，尽管性能不如DNA测序数据。

除HLA等位基因缺失，HLA基因位点变异或表达下调均可影响新抗原呈递，并导致肿瘤免疫逃逸。因此，新抗原预测时，需要考虑HLA基因表达和变异。PolySolver可识别遗传变化，而LOHHLA可识别HLA拷贝数变异导致的杂合性缺失。

-基因组比对和变异检测

HLA分型后，将DNA和RNA测序数据比对到参考基因组，常用的比对软件包括Burrows-Wheeler和STAR。随后是肿瘤特异性变异分析，包括外显子或全基因组肿瘤突变筛选，包括单核苷酸变异（SNVs）、插入和缺失（indels）。

Indels常导致移码变异，导致氨基酸序列和空间结构改变会比较大，与MHC分子结合的亲和力会更强，被T细胞识别为新抗原的可能性越大。

-新抗原结合亲和力和呈递预测

MHC分子呈递的新抗原对于T细胞有效识别至关重要。所有呈递预测模型通过滑动窗口将突变蛋白划分成k-mer肽，MHC-I肽长度通常为8-11个氨基酸（AAs）。

全球大多数的新抗原公司基于高通量测序数据结合亲和力算法进行肿瘤新抗原预测，但由于基因测序所预测的结果不一定会真实表达成新抗原，导致新抗原的发现有较高的假阳性率，带来后期验证成本的巨大浪费。有研究表明，第一代算法预测的肽只有10%可以通过质谱（MS）法在细胞表面检测到。

-新抗原优先排序

新抗原优先排序是最后一个环节。肿瘤新抗原选择联盟发表了一系列特征和相应的阈值，对MHC-I呈递肽的新抗原呈递和免疫原性有显著影响。除了结合亲和力（<34nM）和基因表达水平（>33TPM）外，研究者还发现疏水性和pMHC稳定性（>1.4h）与新抗原呈递相关。

免疫原性预测

可通过体外ELISPOT检测进行免疫原性评估，检测抗原特异性CD8+T细胞产生的细胞因子，或通过细胞内细胞因子染色（肽HLA多聚体染色）进行。体外免疫原性评估至关重要，超过90%的预测新抗原为非免疫原性。然而，尽管目前正在探索新的和优化的筛选方法，但这些检测方法通常耗时且昂贵，进一步延长了生产时间，并增加了治疗的总成本。这也凸显了对创新的智能预测方法的需求。

新抗原选择

新抗原选择的目的是过滤掉不合适的新抗原，只保留高质量新抗原。新抗原肽的数量是另一个关键问题。同时靶向多个表位可产生更强的免疫应答。此外，在治疗中错误的靶点选择和错误的表位识别，新抗原特异性T细胞与非突变抗原的交叉反应，可导致免疫系统不能精准的杀伤肿瘤细胞，造成免疫失衡。

为了平衡这两个因素，通常选择多达20种新抗原肽，最大限度地提高每个患者的免疫原性和真阳性新抗原的比例。

结论

该综述系统阐述了新抗原免疫治疗的精准预测和临床挑战。新抗原鉴定具有挑战性，需跨越各种障碍选择免疫原性表位。近年来，新抗原预测更加准确，并包括了新的变异类型，如基因融合、可变剪接和非经典ORFs。然而，大多数新抗原预测存在假阳性高、无法产生免疫原性、降低治疗成功的机会，且验证过程耗时、成本高。

更多的高通量方法可用于分析感兴趣的复合物，质谱法则可直接鉴定真实呈递在肿瘤细胞表面的新抗原肽，其鉴定的原理是通过pMHC-I免疫沉淀将肿瘤细胞表面的抗原肽从HLA分子上洗脱下来，对其进行质谱测序。目前的质谱技术可从细胞系和患者肿瘤样本中鉴定数千个MHC呈递的肽序列。

除了准确的新抗原识别外，新抗原免疫治疗还面临着临床挑战，最重要的是克服肿瘤异质性。不同免疫类型，其免疫活性各不相同。因此，肿瘤异质性包括肿瘤间异质性和肿瘤内异质性。这也是为什么免疫治疗对一些癌症患者有效，而对患有相同肿瘤类型的其它患者却无效。总之，必须定义肿瘤患者免疫类型，提供有针对性的治疗方案。分析免疫学和突变生物标志物可为每个患者选择合适的治疗方案。同时应重新考虑临床试验方案设计，多个临床试验失败的原因在于患者分层和选择上。

总之，新抗原免疫治疗仍然很有前景。尽管要充分释放新抗原癌症治疗的潜能仍存在挑战，随着对肿瘤异质性了解的深入、对免疫治疗应答的认识有助于选择合适的免疫治疗方案，以及更优的临床试验设计方案。更优的pMHC/TCR亲和力预测模型和对新抗原免疫原性的进一步了解可提升新抗原免疫治疗的稳定性和有效性。新抗原免疫治疗有望在癌症治疗中发挥重要作用，从而实现为每个患者甚至是难治性肿瘤提供免疫治疗。

参考资料

Lybaert et al., Challenges in neoantigen-directed therapeutics, Cancer Cell (2022), https://doi.org/10.1016/j.ccell.2022.10.013