人类精液检查

精子发生是涉及未分化干细胞增殖和分化为精子的过程。它发生在睾丸的曲细精管中，分为三个连续阶段：精原细胞增殖、减数分裂和精子发生。

在光学显微镜下，成熟的人类精子似乎由扁平的椭圆形顶端部分（称为“头部”）、短颈和细长的鞭毛（称为“尾巴”）组成。头部由两个区域组成，即细胞核和顶体。紧凑的细胞核包含具有单倍体染色体结构的浓缩 DNA，并且三分之二被顶体复合体覆盖。这种帽状结构由与核膜接触的内部顶体膜和位于质膜下方的外部顶体膜组成。

顶体源自精子细胞的高尔基体，含有裂解酶——对卵母细胞穿透至关重要。围绕顶体和细胞核的质膜在电子显微镜下通常呈三层结构，外表面有一层厚厚的糖蛋白涂层（精子涂层物质）。

短（仅 1 微米）的颈部从核膜的后部延伸到尾巴的中间部分与头部的连接点。尾部由轴向或轴丝丝状复合体组成，由位于中央的一对微管和排列在外围的九对微管组成（9 + 2 组织）。这种细丝复合体沿着尾巴的整个长度延伸，分为 5-6 μ 长的“中间段”、约 45 μ 长的“主要段”和约 5 μ 长的“末段”。在中间部分，该复合体被九根致密的外部纤维包围，这些外部纤维在与微管接触的地方很细，并且随着它们接近外表面而变粗。它们又被线粒体鞘包围（仅在中间部分），精子呼吸和能量产生所必需的。中间部分通过称为环的结构与主要部分分开，环是粘附在鞭毛膜上的致密材料环。

在主要部分，轴丝和外部纤维被由两列致密纤维组成的纤维鞘包围。这种纤维鞘在主段和末端段的交界处突然终止；末端部分本身由仅由质膜覆盖的轴丝构成。新鲜精子形态在 400 倍和染色涂片上以 1000 倍进行评估。已经提出了许多形态学分类。WHO目前的分类如下（2010）：

椭圆头：普通

头部缺陷

大（巨头畸形）

小（小头畸形）

无定形

锥

梨形

圆形（无顶体；小）

空泡化的

双头

针头

小的或大的顶体区域

颈部和中段缺陷

弯脖子

中间件不对称插入头部

厚插入

薄的

尾部缺陷

短的

循环的

盘绕的

弯曲

双重，多重

破碎的

多余的残留细胞质

1精液的非精子细胞成分

检查新鲜或染色的精液也可发现任何非精子细胞成分。这些可能包括以下内容：

精子发生过程的要素：可能存在精子之前产生的任何细胞要素：

精原细胞

初级精母细胞

次级精母细胞

精子细胞；

白细胞：主要是：

多形核白细胞

淋巴细胞

巨噬细胞;

红细胞;

上皮细胞从附属腺体或泌尿生殖管脱落。

1.1精子发生过程中的要素

精原细胞的细胞质很少，核呈圆形，具有深色（深色，Ad 型）或浅色（浅色，Ap 型）染色质和 1 或 2 个核仁。它们是精液中最不常见的细胞，因为它们与基底膜直接接触，因此距离曲细精管腔更远。

初级精母细胞是具有大中央核的大细胞，其中很少可以看到核仁。染色质的出现取决于减数分裂的阶段；它可能在土块中变厚或显示出特征性的细丝外观，让人联想到脑回旋。

源自细胞质不完全分离的双核元素是常见的发现。由于细胞分裂不完全，精原细胞和精母细胞的分裂不同于体细胞。子细胞通过胞质内桥保持连接，胞质内桥是体细胞中的瞬时结构，但保留在生精上皮中，直到精子细胞分化为精子的最后阶段。

次级精母细胞是具有中央增厚核心的小圆形细胞。它们源自第一次减数分裂并在间期停留很短的时间，因此很少在精液中发现。

精子细胞的形态取决于它们的成熟阶段。a 型和 b 型是具有中央增厚核的小圆形细胞，其特征在于颗粒状染色质和富含源自高尔基体的顶体颗粒的细胞质。c 型和 d 型是细长细胞，其特征是核偏心，染色质更浓缩。

随着成熟的进行，顶体前颗粒合并成一个颗粒形成顶体，染色质进一步压缩，细胞质减少，呈现出唤醒样的外观。此时精子细胞已呈现出精子的形态特征。精子细胞和初级精母细胞是精液中最常见的精子发生过程的组成部分。

2精液的形态学研究

在评估其他精液参数期间，首先在 400 倍的新鲜精液上进行精子形态学分析。然后根据每个样品准备一些载玻片，并在 1000 倍光学显微镜下检查。必须使用脱脂载玻片制备细胞学标本，使涂片均匀分布在整个表面上。如果涂片有回缩的趋势，则应将载玻片浸入无水乙醇或 95% 乙醇中进行预处理，以使样品粘附更完整。

对于通过游动分离的精子或洗涤过的精子的形态学评估，应该记住以这种方式制备的样品不会产生完美的涂片，因为它们不含蛋白质。在这种情况下，建议使用聚赖氨酸包被的载玻片或在细胞悬液中加入 1% 的白蛋白。

2.1精液涂片的制备

使用磨砂边刻有患者姓名的载玻片。

在磨砂边缘末端的幻灯片上滴 10 μL。

将盖玻片（24 × 32 或 24 × 50 毫米）的一端浸入液滴中，让精液扩散。

在载玻片的整个长度上非常轻柔地划线，以最大程度地减少精子损伤。

让空气干燥。

在无水或 95% 乙醇或甲醇中固定载玻片 15 分钟。

让空气干燥，然后染色。

2.2染色技术

4.2.1 May-Grünwald-Giemsa 染色

该方法使用两种染料溶液：Giemsa（蓝色 II-伊红）和 May-Grünwald（亚甲基-伊红蓝），两者均在市场上很容易买到。May-Grünwald-Giemsa 染色可用于风干和固定的涂片；它通过将细胞核染成蓝紫色和将细胞质染成粉红色来进行细胞鉴定。

1. 1.精子程序

用 May-Grünwald 溶液覆盖载玻片 4 分钟。

用蒸馏水冲洗。

用吉姆萨溶液（在蒸馏水中按 1:10 稀释）覆盖载玻片 15 分钟。

用蒸馏水冲洗。

风干，然后安装。

1. 2.生殖细胞程序

用 May-Grünwald 溶液覆盖载玻片 4 分钟。

用蒸馏水冲洗。

用吉姆萨溶液（在蒸馏水中按 1:20 稀释）覆盖载玻片 15 分钟。

用蒸馏水冲洗。

风干，然后安装。

2.2.2精子细胞的差异快速染色

Diff Quik (Dade Behring) 是一种即用型试剂盒，可使用以下溶液进行快速染色：

固定液（甲醇中的三芳基甲烷）；

染色液 1（嗜酸性呫吨）；

染色液 2（嗜碱性噻嗪）。

它产生的染色类似于使用 May-Grünwald-Giemsa 染色所获得的染色。

2.2.3精子细胞巴氏染色

该技术使用核染料（哈里斯苏木精）和两种细胞质染料 [Orange G6 和 EA-50（曙红-酒精）]，所有这些都在市场上很容易买到。这些染料共同作用将细胞核染成深灰蓝色，将细胞质染成粉红色或橙色。

3染色质方面

3.1人类精子中的染色质组织

男性不育症的诊断基于光学显微镜对各种精子参数的评估，例如浓度、活力和形态，这些都是精液质量的重要标志。然而，定量和定性精子分析只是故事的一部分：精子染色质和 DNA 完整性对于胚胎的受精和正常发育也是必不可少的。在精子发生过程中——精子发生的最后阶段，圆形精子细胞转变为成熟的精子——除了这些形态学变化外，基因组还会发生重大重组。鱼精蛋白是仅在雄性中表达的富含精氨酸的物种特异性蛋白质，在这一阶段起着重要作用。

鱼精蛋白一词最初由 Friedrich Miescher 于 1874 年创造，指的是与莱茵鲑鱼精子核的“核素”相关的有机碱基。鱼精蛋白是精子核中最丰富的蛋白质，在其他任何地方都找不到。精子 DNA 与鱼精蛋白紧密结合，呈现高度紧凑的环状结构。DNA-鱼精蛋白相互作用发生在鱼精蛋白的精氨酸结构域和磷酸二酯 DNA 骨架之间。精子核的包装涉及用鱼精蛋白逐步取代体细胞和睾丸组蛋白，尽管大约 15% 的人类精子 DNA 仍然与组蛋白部分结合。最近的研究表明，与精子细胞中 DNA 结合的组蛋白与基因家族相关，在胚胎分化和发育中具有重要作用。

组蛋白/鱼精蛋白转换机制高度复杂且受到精细调控。在此阶段，称为过渡蛋白 (TNP) 的富含精氨酸和赖氨酸的蛋白质与 DNA 结合，从而在鱼精蛋白沉积位点保持中间结构并促进组蛋白消除。在生精过程结束时，TNP 被去除并逐渐被鱼精蛋白取代，鱼精蛋白的高半胱氨酸含量通过形成分子间和分子内二硫键决定染色质的压实。

男性不育的原因之一是与精子染色质异常和 protamination 缺陷相关的精子核变化。生理和环境应激因素、基因突变和染色体异常可以改变精子发生过程中发生的复杂生化过程，对染色质结构和生育能力产生负面影响。例如，氧化应激可诱导精子染色质断裂。在拓扑异构酶 II 修复错误后，精子发生过程中也会出现此类异常。高拓扑异构酶 II 水平和 DNA 链断裂在细长的精子细胞中可能是正常的，这可能是由于需要放松由 DNA 在核凝聚过程中经历的强烈扭转运动引起的张力。在这种情况下，链断裂是由于生理需要，如果它们在精子发生完成之前被拓扑异构酶 II 修复，则不会产生任何负面影响。然而，如果拓扑异构酶 II 的修复能力受到抑制剂影响或阻断，链断裂可能无法完美修复。

精子 DNA 损伤具有多因素病因，可追溯到内源性和环境性睾丸和睾丸后因素。最新理论认为，精子 DNA 损伤是由鱼精蛋白表达改变、氧自由基过量产生或细胞凋亡过程引起的。细胞凋亡是一种基于遗传机制的细胞死亡形式，该机制会诱导许多细胞、形态和生化变化，从而导致细胞“自杀”。在形态学上，凋亡细胞的特征是细胞骨架发生改变。染色质变得固缩并在核膜上积累（染色质边缘化），从而产生细胞外观，一个多世纪以来启发了各种定义（半月形、马蹄形、镰刀形等）。生物化学上，细胞凋亡最重要的特征之一是钙/镁依赖性核酸内切酶的激活。它们以特定方式将细胞 DNA 片段化为大约 185 bp 的核小体单元。细胞凋亡过程也与导致成熟精子的分化和成熟过程的调节有关。精原细胞的克隆扩增实际上明显过度，需要一种机制来根据支持细胞的数量来对抗这种生长。人类精子发生的低效率是有据可查的：初级精母细胞只产生两个精子细胞，而不是理论上可以预测的四个。细胞凋亡过程也与导致成熟精子的分化和成熟过程的调节有关。精原细胞的克隆扩增实际上明显过度，需要一种机制来根据支持细胞的数量来对抗这种生长。人类精子发生的低效率是有据可查的：初级精母细胞只产生两个精子细胞，而不是理论上可以预测的四个。细胞凋亡过程也与导致成熟精子的分化和成熟过程的调节有关。精原细胞的克隆扩增实际上明显过度，需要一种机制来根据支持细胞的数量来对抗这种生长。人类精子发生的低效率是有据可查的：初级精母细胞只产生两个精子细胞，而不是理论上可以预测的四个。

可以使用多种方法研究精子核完整性。最常见的是 TUNEL，它基于一种酶的使用，即末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)，它催化荧光素标记的核苷酸聚合到片段化 DNA 的 3'-OH 末端。

鉴于现在辅助生殖技术 (ART) 的广泛使用，对精子 DNA 损伤的研究尤为重要，并且正在寻找一种可以预测受精、胚胎质量和植入成功的测试。近年来，人们做出了许多努力来确定评估精子 DNA 损伤的合适测试。然而，此类测试的临床意义尚未确定。许多研究已经使用 TUNEL 来证明不育患者以及患有男科和肿瘤疾病患者的精子中的核碎裂 ( Gandini et al. Hum. Reprod.,15:830, 2000)). 这些研究表明精子中的碎片可能是各种病原体或精子发生控制系统失调的结果。其他研究将精子碎片与生殖结果相关联，尤其是与 ART 中妊娠率降低和流产风险增加相关。应该记住，对繁殖成功的最终影响不仅取决于精子 DNA 损伤的类型和程度，还取决于卵母细胞修复这种损伤的能力。事实上，异常染色质结构的生物学效应取决于精子染色质损伤程度和卵母细胞质量的结合。