重磅科研 | Nature：肠道衍生代谢物改变了小鼠的大脑活动和焦虑行为

编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

来自环境的感觉和分子输入的整合塑造了动物的行为。暴露于环境分子的一个主要部位是胃肠道，在胃肠道中，膳食成分被微生物群化学转化，肠道衍生的代谢物扩散到包括大脑在内的所有器官。肠道微生物群影响小鼠行为，调节肠道和大脑中神经递质的产生，并影响大脑发育和髓鞘形成模式。尽管广泛涉及体液或神经元连接，但介导肠-脑相互作用的机制仍不清楚。我们之前报道过，在非典型神经发育的小鼠模型中，微生物代谢物4-乙基苯酚硫酸盐(4EPS)的水平升高。在本研究中，我们从肠道微生物中鉴定了介导膳食中酪氨酸转化为4-乙基苯酚(4EP)的生物合成基因，以及在小鼠中选择性产生4EPS的工程肠道细菌。4EPS进入大脑并与特定区域活动和功能连接的变化有关。基因表达特征揭示了大脑中少突胶质细胞功能的改变，4EPS损害了小鼠少突胶质细胞的成熟，并减少了离体脑培养中少突胶质细胞-神经元相互作用。产生4EP的细菌定殖的小鼠表现出神经元轴突的髓鞘形成减少。大脑中髓鞘形成动力学的改变与行为结果有关。因此，我们观察到暴露于4EPS的小鼠表现出焦虑样行为，而促进少突胶质细胞分化的药物治疗阻止了4EPS的行为影响。这些发现表明，肠道衍生分子通过影响大脑中的少突胶质细胞功能和髓鞘形成模式来影响小鼠的复杂行为。  

论文ID

原名：A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice 

译名：肠道衍生代谢物改变了小鼠的大脑活动和焦虑行为

期刊：Nature

IF：69.504

发表时间：2022.2

通讯作者：Brittany D. Needham ＆ Sarkis K. Mazmanian

通讯作者单位：美国加州理工学院

DOI号：10.1038/s41586-022-04396-8

实验设计

结果

先前在非典型神经发育的小鼠模型中以较高的相对丰度测量了代谢产物4EPS，将合成的4EPS系统性地输送到naive小鼠会改变它们在野外试验中的行为。我们最近报道了自闭症谱系障碍(ASD)患者血浆中的4EPS增加，并在此表明它在ASD的CNTNAP2小鼠模型中，血液中4EPS增加(扩展数据图1f)。据预测，肠道微生物群中含有将酪氨酸(几种哺乳动物神经递质的来源)转化为4EP的基因，然后宿主可以将其硫酸化为4EPS(图1a)。与这一概念相一致的是，缺乏微生物群的无菌(GF)小鼠几乎不含有可检测到的4EPS水平(扩展数据图1f)。在厚壁菌门中的一些稀有细菌物种利用对香豆酸作为底物产生4EP，对香豆酸的前体如酪氨酸或植物基分子，它们可以被肠道微生物群代谢为4EP。事实上，无论是高酪氨酸鱼为主的饮食，还是大豆为主的饮食，都可以在常规定殖小鼠中产生可测量的4EPS水平(扩展数据图1g)。通过筛选候选肠道细菌，我们发现卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)从酪氨酸中产生对香豆酸(图1b)。利用BLAST分析，我们在卵形拟杆菌(BACOVA_01194)中鉴定出一种酪氨酸解氨酶，该酶的缺失使对香豆酸的产生消失(图1b)。

我们将GF小鼠与卵形拟杆菌和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)共定殖，后者可将对香豆酸转化为4EP；然而，由此产生的尿液中4EPS水平很低(扩展数据图1f,h)。为了提高4EP生产效率，我们进行了几轮菌株工程。简而言之，将该途径中前两个基因BACOVA_01194和酚酸脱羧酶(pad)基因的额外拷贝作为一个单独的、高表达的操纵子插入到B. ovatus中(图1c)。工程培养的B. ovatus菌株MFA05能将酪氨酸转化为中间产物4-乙基苯酚(图1c，扩展数据图1a-e)，并且在与植物乳杆菌(L. plantarum)共培养时，4-乙基苯酚定量代谢为4EP(图1d)。相比之下，当B. ovatusΔ1194突变体与L. plantarum共培养时，未检测到4EP(图1d)。我们在约25个已测序的人类肠道微生物基因组中发现了每个基因的同源物，这表明在人类肠道微生物中可能存在完整的共同途径(扩展数据图1i)。

 图1 4EP生物合成途径的发现、肠道细菌的菌株工程和小鼠定殖产生4EP。

a提出了肠道细菌4EP的生物合成途径：通过酪氨酸解氨酶(AL，由BACOVA_01194编码)、酚酸脱羧酶(PAD)和乙基苯酚还原酶(VPR)，然后通过宿主硫酸基转移酶(SULT1A1)将其硫酸化为4EPS。经菌株工程鉴定和克隆的基因可通过两种化学中间体将酪氨酸转化为4EP。b,c 4EP前体、对香豆酸和4-乙基苯酚来自以酪氨酸为底物的B. ovatus菌株的体外培养。b BACOVA_01194基因产物(图中AL/1194)和缺失突变体(MFA01)分别将酪氨酸转化或缺失为对香豆酸。c除pad基因(MFA04)外，BACOVA_01194基因(图中AL/1194)被单独引入(MFA02)，或同时引入两个基因作为单个高表达操纵子(MFA05)。标准显示在顶部。进一步的细节在方法、扩展数据图1和补充表1中提供。d 4EP-菌株对(B. ovatusΔ1194(MFA01)和L. plantarum)或产生最高4-乙基苯酚的工程菌株B. ovatus 1194/PAD(MFA05)和L. plantarum(4EP+菌株对)体外培养(提供酪氨酸)中的4EP水平。标准显示在顶部。e缺乏(4EP-)和产生(4EP+) 4EP的菌株(n=5)定殖的小鼠粪便中4EP水平(μg/mg)。f 4EP-或4EP+(n=9)菌株定殖的小鼠尿液中4EPS的水平。额外的尿液数据在扩展数据图1k中提供。g 4EP-(n=4)和4EP+(n=6)菌株定殖的小鼠脑内4EPS(注射丙磺舒后)的水平。附加对照如扩展数据图1f所示。每个实验至少进行两个生物学独立试验。ND,未检测到；数据为均值±SEM。

1 循环和大脑中的肠源性4EPS

我们用这两种工程菌株中的任意一种定殖不同组的GF小鼠，如图1d所示，产生4EP+或4EP-小鼠。如预期的那样，在粪便中检测到4EP(图1e)，并且在4EP+定殖小鼠的血清和尿液中检测到其宿主硫酸化衍生物4EPS(图1f，扩展数据图1j)。4EP+小鼠血清中未检测到4EP，表明4EP被有效硫酸化(扩展数据图1j)。相反，4EP-小鼠没有可检测到的4EP或4EPS水平(图1e,f，扩展数据图1j)。接受丙磺舒治疗的4EP+小鼠大脑中可检测到4EPS，丙磺舒可抑制有机阴离子转运体介导小分子通过血脑屏障流出，表明4EPS在大脑中积累(图1g，扩展数据图1k-m)。在体外生化反应中，我们观察到硫酸基转移酶SULT1A1和其他酶将4EP转化为4EPS(扩展数据图2a,b)。在小鼠的肠道、肝脏和脑组织中发现了SULT1A1(扩展数据图2c,d)，尽管4EP硫酸化的位置尚不清楚。

4EP和4EPS是酚类分子，可能具有毒性或炎症性质。然而，我们观察到4EP+组和4EP-组在体重或活动(即运动)方面没有差异(扩展数据图2f,g)。在评估上皮通透性(扩展数据图2h)、粪便排出量(扩展数据图2i)或组织病理学(扩展数据图2j)时，4EP+小鼠未发现肠功能障碍的证据。各组小鼠的细菌定殖水平和细菌超微结构定位相似(扩展数据图2k-m)。我们在结肠组织或血清中未观察到促炎细胞因子的反应(扩展数据图3a,b)，仅观察到外周免疫细胞比例的适度变化(扩展数据图3c,d)。在4EP+小鼠中，细胞因子水平倾向于抗炎，没有小胶质细胞激活的信号(扩展数据图3e-g)。总体上，这些研究建立了一个简化的动物模型，再现了与行为改变相关的肠道微生物代谢物的自然暴露途径(扩展数据图2e)。

2 4EPS依赖的大脑活动模式

虽然4EP或4EPS(以下简称4EP(S))可能对各种器官产生影响，但我们的研究重点是大脑。最初，为了捕捉4EP+和4EP-小鼠的全脑差异，我们进行了功能超声成像(fUSi)，这是一种测量静息状态脑血容量变化以评估功能连通性的体内方法(扩展数据图4a)。我们观察到，与4EP-小鼠相比，4EP+小鼠的信号通路模式的相关性改变(主要增强)(图2a)。这些变化主要在海马、丘脑、杏仁核、下丘脑、梨状核和皮层的亚区观察到(图2b，扩展数据图4b)，表明4EPS的升高与小鼠大脑各区域间异常的功能连接有关。

为了比较整个大脑的神经活动，我们绘制了葡萄糖摄取图，其中系统注射放射性标记示踪剂([14C]-2-脱氧葡萄糖(2DG))迅速整合到活跃的大脑区域。通过对4EP+小鼠和4EP-小鼠的脑切片进行放射自显影分析来评估脑活动的变化。4EP(S)与下丘脑(前区、外侧核和室旁核)、杏仁核(前区、基底外侧核、中央核和皮层)、终纹床核(BNST)以及丘脑室旁核(PVT)的葡萄糖摄取增加有关(图2c,d)。我们还绘制了行为任务(旷场探索实验)期间的摄取图，在该任务中，我们观察到某些区域(杏仁核、下丘脑、BNST和PVT)活动增加的重叠，以及刺激条件之间这些变化的空间范围存在差异(扩展数据图4c-e)。该分析强调的区域对一系列功能都很重要，包括调节对先天和后天恐惧刺激和焦虑反应的适当反应。我们的结论是，小鼠肠道暴露于4EP会导致大脑多个区域的功能连接和活动发生改变，包括几个与边缘系统相关的区域。

图2 大脑功能连接和区域激活因4EP产生菌的定殖而改变。

a fUSi平均连接矩阵与各组4EP+和4EP-(n=7)以及每个冠状面(前囟-0.9 mm、-1.6 mm和-2 mm)的大脑区域信号相关。Pearson相关系数(r)根据右边的图例用颜色表示。感兴趣区域(ROI)的位置分类如下；扩展数据图4a、b和补充表4提供了更多细节。b与4EP-组相比，4EP+组的连通性显著不同。区域对由相同颜色的P值表示(根据图例)，并在必要时进一步用虚线表示。标志性脑区域用黑色标记，特定ROI在扩展数据图4b和补充表4中定义。使用配对t检验对每个连接矩阵进行分析，并使用Bonferroni校正控制多重比较。c,d小鼠大脑模板的代表性冠状面(c)和矢状面(d)切片的颜色编码重叠显示4EP+小鼠与4EP-小鼠的局部脑葡萄糖摄取存在显著差异。n=11；采用t检验进行统计分析；P≤0.05，范围阈值>200相邻体素，两种条件均满足视为显著。红色和蓝色分别表示，与4EP-小鼠相比，4EP+小鼠的葡萄糖摄取增加和减少。图中每个实验都使用来自多窝小鼠的两个独立队列。AM，杏仁核；Cb，小脑蚓部；CC，胼胝体；CTX，皮层；En，内梨状核；GP，苍白球；HPC，海马；HY，下丘脑；L.，左；LS，外侧隔；Pn，脑桥网状核；R.，右；RT/VPL，丘脑网状/腹侧后外侧核；TH，丘脑。

3 少突胶质细胞成熟改变

为了确定4EP(S)对大脑的分子效应，我们对4EP+和4EP-小鼠的6个大脑区域进行了mRNA测序(QuantSeq)，包括PVT、基底外侧杏仁核、下丘脑、BNST、内侧前额叶皮层(mPFC)和腹侧海马体，结果显示大脑区域的转录组谱紧密聚类(扩展数据图5a)。4EP(S)主要影响PVT的整体基因表达，BNST和基底外侧杏仁核的表达程度较低(图3a，扩展数据图5b,e)。使用注释的GO术语将差异表达基因聚合为功能类别，揭示了在4EP+小鼠的PVT中Notch信号通路升高，而与树突和神经元投射发育相关的GO术语下降(扩展数据图5c,d)。细胞特异性富集分析显示，与4EP-小鼠相比，4EP+小鼠PVT中神经元、新形成的少突胶质细胞和成熟的少突胶质细胞的基因表达下降(图3b)，表明这些细胞类型的发育、丰度和/或活性的潜在降低与暴露于4EP(S)有关。未成熟少突胶质细胞增殖的增加和向成熟少突胶质细胞分化的减少与Notch信号的升高有关。成熟少突胶质细胞用髓磷脂隔离神经元投射，髓磷脂是一种促进动作电位沿轴突传导的脂肪鞘。因此,许多成熟少突胶质细胞的标志基因(如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Mog)和Opalin基因)在4EP+小鼠的PVT中下调，而与非髓鞘少突胶质祖细胞相关的一些基因则升高(图3c，扩展数据图5f，补充信息)。通过对2DG摄取数据的种子分析，我们观察到4EP+组(168042体素)的PVT与大脑其他部分之间的显著相关性低于4EP-组(271392体素)，与4EP-组相比，4EP+组的正相关数量减少(61572 vs. 141493体素)，这在很大程度上推动了这一效应(图3d，扩展数据图5g)。

我们验证了4EP(S)影响少突胶质细胞成熟的假设。PVT免疫染色显示，4EP+小鼠中神经/胶质抗原2(NG2)的表达增加，表明少突胶质细胞前体细胞未成熟，同时anti-CC1抗体染色的成熟少突胶质细胞标志物水平降低(图3e,f，扩展数据图5h-o)。流式细胞术和Western blotting分析证实，4EP+小鼠少突胶质细胞倾向于未成熟(图3g,h，扩展数据图6a-c)。NeuN(泛神经元标记物)和OLIG2(泛少突胶质细胞标记物)的水平没有变化(扩展数据图5k-n)，这表明4EP(S)对少突胶质细胞成熟产生影响，而不是该谱系中细胞总数的改变。这些数据表明，暴露于4EP(S)可导致少突胶质细胞成熟减少。

在存在4EPS的器官型脑片中观察到类似的表型。4EPS处理的离体脑组织显示早期少突胶质细胞标记物NG2的水平相对于成熟标记物CC1的水平增加(图3i，扩展数据图6d)，且髓鞘与神经元轴突的共定位减少(图3j,k，扩展数据图6e)。此外，成熟少突胶质细胞的功能标记物(MOG和髓鞘碱性蛋白(MBP))在4EPS处理的样本中较低，而编码NG2(Cspg4)的基因转录增加(图3l，扩展数据图6f,g)。虽然4EPS进入大脑并对脑组织有直接影响，但我们不能排除外围影响。

图3 4EP+小鼠少突胶质细胞成熟减少。

a使用QuantSeq测定基线小鼠大脑区域差异基因的数量(n=5)。采用Tukey检验的单因素方差分析进行统计分析。b细胞特异性富集分析；P<0.05显示在具有白色值的红色单元格中。c分化少突胶质祖细胞(OPCs)和成熟少突胶质细胞基因的代表性子集。采用Tukey检验的单因素方差分析进行统计分析。框限显示第25至75个百分点，中线显示中间值，上下线显示最小和最大点；n=5。d利用2DG摄取数据分析全脑与PVT种子的相关性。n=11；显示了PVT(红色截面)。使用单尾多元线性回归进行统计分析，最小阈值为200相邻体素，P<0.05。e 4EP-和4EP+小鼠的代表性脑切片图像；NG2(红色)和CC1(绿色)。比例尺为100 μm。f PVT中少突胶质细胞的成熟指数。n=8个生物学独立小鼠的累积总数。P=0.004。g对PVT细胞进行定量流式细胞术分析，比较MOG+象限4群体与NG2+象限1群体。n=4个由5个PVT组成的池。P=0.03。h代表性流式图。i-l用10μM 4EPS处理的器官型脑片。每个数据点代表单独的生物重复。i少突胶质细胞的成熟指数，使用每个重复3-5张图像的总累积计数。n=9(veh.)和n=10(4EPS)；P=0.003。j神经丝(NF)和蛋白脂蛋白(PLP)抗体染色的共定位百分比。n=6；P=0.01。k实验代表性图像，比例尺为20 μm。l切片中MBP的Western blot分析。n=6；P=0.04。Astro，星形胶质细胞；BLA，基底外侧杏仁核；CC1，腺瘤性大肠息肉；Endo，内皮；Micro，小胶质细胞；MO，成熟少突胶质细胞；NFO，新形成的少突胶质细胞；vHPC，腹侧海马。在l组中进行的实验包括在一个(a-c)或两个(d-l)实验中检查的多个随机窝的生物学独立小鼠。数据为均值±SEM。对于e-l，采用双尾Welch’s t检验进行统计分析；*P≤0.05，**P≤0.01。

4 4EP+小鼠神经元髓鞘形成减少

使用电子显微镜断层扫描技术来检查胼胝体致密且有组织的轴突束中髓鞘的超微结构，以促进髓鞘定量。我们观察到，与4EP-小鼠相比，4EP+小鼠大脑中无髓轴突与有髓轴突的比例显著增加(图4a,d)，以及4EP+小鼠的标准化(通过增加g-比率或髓鞘内径和外径之间的比值表示)和实际髓鞘厚度降低(图4b-d，扩展数据图7a-e)。因此，与成熟少突胶质细胞的减少相一致，4EP(S)暴露降低了大脑中髓鞘形成的频率和效率。

弥散张量成像是一种磁共振成像方式，可以评估大脑中有髓神经束的扩散情况，用于研究PVT和大脑其他部分之间髓鞘的结构连接。我们发现，与4EP-小鼠相比，4EP+小鼠的分数各向异性(FA)更低，表明其弥散性更强，不是线性/受限扩散(图4e和扩展数据图7f)。在全脑和胼胝体中也观察到类似的髓鞘形成缺陷(扩展数据图7g-i)。髓鞘动力学和大脑连接改变的重要性是行为神经科学中的一个新兴概念。

图4 4EP(S)改变髓鞘形成和焦虑样行为。

a无髓鞘轴突的百分比。n=3；对从每个生物重复中获得的四幅图像进行评分。P=0.005。b所有轴突(n=56(4EP-)和n=70(4EP+)轴突)的g-比率(r/R)；n=4只小鼠。对从每个生物重复中获得的四幅图像进行评分；P=0.0001。r，轴突内径；R，髓鞘外径。c髓鞘宽度(n=56(4EP-)和n=70(4EP+)轴突)。n=4只小鼠。对从每个生物重复中获得的四幅图像进行评分；P=0.003。d 4只小鼠的代表性电子断层扫描图像。有髓轴突和无髓轴突分别用蓝色和橙色箭头标记。e利用弥散张量成像测量分数各向异性(FA)。n=4只小鼠；P=0.04。比例尺为1μm(上)、0.5μm(中)和0.05μm(下)。f EPM实验:在开放臂末端(外三分之一)停留的时间。n=21(4EP+)和n=24(4EP-)；P=0.003。g旷场实验。n=21(4EP+)和n=24(4EP-)；P=0.002。h，掩埋弹珠的数量。n=24(4EP+)和n=23(4EP-)。P=0.02。i用或不用富马酸氯马斯汀处理的4EP-和4EP+小鼠PVT中少突胶质细胞的成熟指数。个体小鼠的累积总数：n=7(4EP-，对照)，n=10(4EP-，处理)，n=6(4EP+，对照)和n=6(4EP+，处理)。对照4EP- vs. 4EP+：P=0.03；4EP+对照vs.处理组：P=0.01。j用或不用富马酸氯马斯汀处理的小鼠的代表性脑切片图像，CC1(绿色)和NG2(红色)染色。k-m对使用或不使用富马酸氯马斯汀的小鼠进行行为测试(与之前使用的队列无关)。k EPM实验。n=13(4EP-对照)，n=13(4EP-处理)，n=12(4EP+对照)，n=14(4EP+处理)。4EP+对照vs.处理组：P=0.05。l旷场实验。n=15(4EP-，对照)，n=17(4EP-，处理)，n=17(4EP+，对照)，n=17(4EP+，处理)；P=0.04。m掩埋弹珠的数量。n=15(4EP-，对照)，n=17(4EP-，处理)，n=17(4EP+，对照)，n=17(4EP+，处理)。对照4EP- vs. 4EP+：P=0.009；4EP+对照vs.处理组：P=0.03。所有的实验都使用了来自两个实验的随机多窝的生物学独立小鼠。对于a-m，数据为均值±SEM。统计分析采用双尾Welch’s t检验(a-h)或Dunnett检验的双因素方差分析进行统计分析，对4EP+对照组进行多重比较(i-m)；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。

5 4EP(S)会增加焦虑样行为

我们之前的研究和在本研究中观察到的边缘系统4EP(S)依赖性变化促使我们研究肠道中4EP的产生是否可以调节小鼠的复杂行为。在几种测试范式实验中，4EP(S)促进了强烈的焦虑样行为：(1)高架十字迷宫(EPM)，其中4EP+小鼠在开放臂末端停留的时间较少；(2)旷场探索实验，在这种情况下，老鼠较少冒险进入更暴露的区域；和(3)亮/暗箱，4EP+小鼠在黑暗中待的时间更长(图4f,g，扩展数据图8a,c)。4EP+小鼠也表现出弹珠掩埋增加，反映了焦虑和/或刻板行为的特征，但没有增加自我修饰(图4h，扩展数据图8d)。除了焦虑样行为外，4EP+小鼠在直接社交互动实验中通过增加肛门生殖器嗅探表现出轻微的社交改变(扩展数据图8e)。在成人超声波发声测试中，雄性4EP+小鼠向新的年龄匹配的雌性小鼠发出的听觉交流显著减少(扩展数据图8f)。有趣的是，两组之间的认知或运动功能没有显著差异(基于新物体识别、Y-迷宫交替行为测试、横梁跨越或金属丝悬挂实验)(扩展数据图8g-k)，这进一步表明4EP(S)的效果对情绪行为具有选择性。我们的还原模型系统使用人工微生物组来研究肠道微生物代谢物的作用(扩展数据图8l)。重要的是，口服4EP(S)以提高常规定殖小鼠的水平也增加了焦虑样行为，并减少了少突胶质细胞的成熟(扩展数据图9a-j)。4EP-小鼠的行为与常规定殖对照小鼠相似(扩展数据图9k,l)，表明4EP(S)的行为效应并非特定于无菌小鼠。

最后，我们试图确定4EP(S)介导的对少突胶质细胞的影响是否有助于改变行为。通过脑切片CC1和NG2染色检测，给药可促进少突胶质细胞成熟的富马酸氯马斯汀可增加4EP+小鼠成熟少突胶质细胞比例(图4i,j，扩展数据图10a)。值得注意的是，促进少突胶质细胞的成熟可以阻止4EP+小鼠的行为变化，包括EPM、旷场实验和弹珠掩埋试验的改变(图4k-m，扩展数据图10c,e,f)。我们观察到另一种诱导髓鞘形成的药物咪康唑对焦虑样行为有类似的改善作用(扩展数据图10b,d,g-i)。我们得出结论，4EP（S）影响小鼠的焦虑样行为，包括对少突胶质细胞成熟的影响。

讨论

在本研究中我们发现了一种产生肠道微生物代谢物4EP的生物合成途径。虽然这一途径可以使用酪氨酸作为前体，但我们发现，其他膳食来源也可以被肠道微生物群代谢为4EP，并且预计在人类中，不同的膳食和微生物群落结构可能会影响循环代谢物水平。我们还发现，4EP被硫酸化，4EPS进入小鼠大脑，与特定大脑区域的激活和连接改变有关，并破坏了大脑中少突胶质细胞的成熟和髓鞘形成模式。已知环境线索对少突胶质细胞-神经相互作用有局部影响，影响控制特定行为的脑回路。虽然其他大脑区域可能参与了4EP(S)反应，因为我们检测到激活模式的广泛变化，PVT接收感觉和认知输入，在局部整合这些线索，并将微调信号输出到皮层和皮层下区域，从而产生应用行为反应。事实上，我们发现肠道暴露于4EP会改变小鼠的一些情绪行为，但不会改变非情绪行为。未来的研究将集中于揭示4EPS如何导致少突胶质细胞成熟和髓鞘形成的变化，定义受到因果影响的大脑区域，并研究髓鞘形成的变化如何影响行为。我们的数据无法确定4EPS是神经活性代谢物，还是4EP或未知的分解产物。对进入大脑并影响大脑活动的肠道微生物代谢物的鉴定定义了焦虑样行为的环境影响因素。

肠道细菌可以合成经典的神经递质，如多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺和γ-氨基丁酸，并且假设微生物群可以产生新的神经活性代谢物。具有类似于4EP(S)酚类结构的分子在几种临床前行为模型以及某些神经精神疾病中失调。值得注意的是，与4EP密切相关的酪氨酸代谢物对甲酚已被认为会影响少突胶质细胞的功能，并影响小鼠的社交和抑郁样行为。在非人类灵长类动物中，4EPS的增加与异常重复行为有关，在ASD患者中，血浆4EPS水平显著升高。此外，在同一队列中，几种相关代谢物的相对丰度发生了变化，如2-乙基苯基硫酸盐、4-烯丙基苯基硫酸盐和4-甲苯磺酸盐。我们提出假设，即4EP(S)代表了影响动物大脑活动和复杂行为的神经活性微生物分子的典型例子，在概念上类似于调节神经系统功能的哺乳动物神经递质。