简单的WGCNA流程，发表6分+

导语

寻找与宫颈癌侵袭和转移相关的生物标志物至关重要，这将有助于改善晚期患者的个体化治疗方法。

背景介绍                    

今天  小编为大  家带来一篇加权基因共表达网络分析（WGCNA）的套路文章，发表在Front.  Cell Dev. Biol.，影响因子6分+，题目为  Identification of Stemness-Related Genes for Cervical Squamous Cell Carcinoma and Endocervical Adenocarcinoma by Integrated Bioinformatics Analysis。

研究流程    

图1

数据介绍                    

从TCGA数据库中获得了126例宫颈癌样本的RNA-seq表达谱数据。

结果解析                     

01   差异表达基因的鉴定和功能注释  

作者通过热图（图2B）和火山图（图2C）鉴定了在10个转移和116个非转移CESC宫颈癌样本之间的差异表达基因。

使用GO和KEGG注释差异表达基因的功能。结果显示，GO富集在突触膜和通道活性（图 2D）。KEGG富集在神经活性配体-受体相互作用（图2E）。

图2

02   WGCNA网络  

作者基于TCGA数据集选择了干性指数相关基因。为了筛选与宫颈癌显著相关的基因，利用WGCNA构建了差异表达共表达网络（ 图3A，B ） 。作者提取了19个不同颜色的基因模块，这些基因具有相似的表达模式，用于进一步分析（图3C）。

为了分析基因模块与mRNAsi评分之间的相关性，将MM定义为相关模块的整体基因表达水平，以计算与表型的相关性。 同时，研究了基因表达与癌症特征之间的相关性。黄色模块与mRNAsi评分的负相关度最高，相关性接近-0.7。因此，将黄色模块视为关键模块，从中提取关键基因（ 图3D ）。

图3

作者利用差异表达分析筛选差异表达干性相关基因（DESRG）（ 图4A，B ）。最终提取81个DESRG进行后续分析。同时，还鉴定了18个与黄色模块显著相关的癌症标志，以供进一步分析。

图4

03   构建预后模型  

将差异表达的干性相关基因整合到风险模型中，评估宫颈癌患者的预后值（图4C）。 这些基因被纳入多变量 Cox模型中，该模型的公式用于计算每个宫颈癌患者的风险评分。宫颈癌样本根据风险评分中位数分为低风险组和高风险组。

散点图和风险曲线说明了宫颈癌患者的风险评分和生命状态（图5A，B）。计算受试者ROC曲线以量化模型的预测准确性（图5C），该模型具有令人满意的预后值（AUC = 0.842）。此外，Kaplan-Meier生存曲线显示，低风险组的生存率明显延长于高风险组，表明风险评分具有很高的预后价值（ 图5D ）。在多变量Cox回归分析中，风险评分代表一个独立的预后指标（ 图5E ）。

图5

04   转录因子、hub基因和信号通路  

热图（图6A）和火山图（图6B）说明了宫颈癌和正常组织之间50种特征的差异表达水平。GSVA和GSEA分析分别进一步评估了50种癌症标志的差异表达水平（图6C，D）。

图6

采用EdgeR方法鉴定FDR值<0.05的差异表达转录因子。热图显示了从 318个TF中提取的65个差异表达的TF（图7A）。通过共表达分析鉴定与关键基因显著相关的上游转录因子。总的来说，基于通过GSVA在转移和非转移样本之间显着共表达的22个癌症特征和18个显著不同的癌症特征，从交叉中提取了8个下游机制（图7B）。

在转录因子，DESRG和癌症标志之间进行共表达分析，利用共表达相互作用对构建调控网络（图7C）。随后，为了量化22个Hallmark基因集，10个转录因子和48个DESRG之间的相互作用系数，在转录水平上进行了共表达分析（图7D）。转录因子 NR5A2与关键基因VIM之间存在明显的共表达模式（R=0.843，P<0.001），VIM与标志性上皮间充质转化（EMT）途径显著共表达（R=0.318，P<0.001）。 综上，VIM受NR5A2正向调控，标志性的EMT是VIM在宫颈癌转移中的潜在下游途径。

图7

05   生物活性小分子抑制剂的鉴定  

作者在热图中显示了10多种癌症中的生物活性小分子（图8A）。结果表明，柚皮素（图8B）、地昔帕明（图8C）、阿维斯霉素（图8D）和益康唑（图8E）是抑制宫颈癌的最佳化合物。经过综合分析，柚皮素通过靶向DESRGs和参与SNAL2和MMP2等标志性EMT基因集的基因，被选为CESC开发中的生物活性小分子抑制剂。

图8

06   ChIP-seq验证  

基于Cistrome数据库（智人）中NR5A2的ChIP-seq数据，在VIM序列中发现了多个结合峰（图9）。因此，可以确定NR5A2与VIM之间的直接转录调控关系。

图9

07   ATAC-seq验证  

使用ATAC-seq分析鉴定分选的宫颈癌细胞中的多个开放染色质区域（图10）。在宫颈癌细胞的NR5A2启动子以及邻近基因的内含子和内含子中的已知增强子处存在强烈的ATAC-seq结合峰，表明这些区域可能作为NR5A2的增强子起作用。

图10

小编总结                    

本研究基于TCGA的126个样本、318个转录因子和50个癌症标志， 使用e dgeR鉴定10个转移和116个非转移样本之间的差异表达基因。WGCNA分析中的 黄色模块 为兴趣模块，与基于mRNAsi评分的肿瘤干性显着相关。

作者采用单因素Cox回归和多因素Cox回归分别评估关键基因的预后价值和风险评分。 VIM 被推测为最重要的预后基因。 建立了基于上述81个关键基因的预后模型，具有较高的可靠性 ，可有效预测宫颈癌患者的生存结局，表明mRNAsi与预后不良之间存在正向相互作用。 基于转录因子与关键基因之间的显著相关性分析， NR5A2 （TF）和 VIM （关键基因）对被认为是显著的 。 基于 VIM 与50个癌症标志之间的相关性分析，标志EMT 被确定为最重要的下游途径。

最终，作者假设VIM受到 NR5A2 的正调控，并且EMT是宫颈癌转移中 VIM 的潜在 下游。 柚皮素被确定为最重要的生物活性小分子抑制剂，通过靶向参与标志性EMT基因集的 NAL2 和 MMP2 来 抑制宫颈癌转移