科研丨北大＆同济医院: 肠道菌群产生的三甲基-5-氨基戊酸可减少脂肪酸氧化并加速心脏肥大(国人佳作)

编译：微科盟煎蛋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读   许多研究发现肠道微生物群的改变通过产生肠道衍生代谢物来影响各种疾病的发展。然而，特定代谢物及其对心肌肥厚或心力衰竭进展的病理生理学贡献仍不清楚。在一项前瞻性心力衰竭队列研究中，随着三甲基-5-氨基戊酸(TMAVA)水平升高，心脏死亡和移植风险逐渐升高(n =1647)。TMAVA处理加重了高脂饮食喂养小鼠的心肌肥厚和功能障碍。脂肪酸氧化(FAO)降低是病变心脏代谢重编程的标志，并导致心肌能量受损和收缩功能障碍。蛋白质组学研究发现，TMAVA扰乱心脏能量代谢，导致FAO抑制和心肌脂质积累。TMAVA处理改变了线粒体超微结构、呼吸和FAO，并抑制了肉碱代谢。γ-丁基甜菜碱羟化酶(BBOX)缺乏小鼠表现出相似的心肌肥厚表型，表明TMAVA通过BBOX发挥作用。最后，外源性肉碱补充可逆转TMAVA诱导的心肌肥厚。这些数据表明，肠道菌群衍生的TMAVA是通过抑制肉碱合成和随后的FAO而导致心肌肥厚的关键决定因素。    

论文ID

原名：Gut microbiota production of trimethyl-5-aminovaleric acid reduces fatty acid oxidation and accelerates cardiac hypertrophy

译名：肠道菌群产生的三甲基-5-氨基戊酸可减少脂肪酸氧化并加速心脏肥大

期刊：Nature Communications

IF：17.694

发表时间：2022.4

通讯作者：郑乐民，汪道文

通讯作者单位：北京大学心血管研究所，华中科技大学同济医学院附属同济医院

DOI号：10.1038/s41467-022-29060-7

实验设计

结果

1 TMAVA水平升高与心力衰竭(HF)风险增加相关

在先前发表的非靶向代谢组学研究中，我们发现高血压患者的TMAVA显著且持续升高，这是已知的心肌肥厚驱动因素。在对包含1647名患者的队列进行84个月的随访中，387名患者发生了主要结局(包括心源性死亡和移植)。当队列根据TMAVA水平分为四个四分位数时(Q1 ≤ 0.300；Q2 = 0.300–0.472；Q3 = 0.472–0.742；Q4 > 0.742)，与最低四分位数相比，处于最高四分位数(Q4)的患者发生心源性死亡的风险显著升高1.76(95% CI：1.34-2.34；P < 0.001)。Kaplan-Meier分析还显示与TMAVA水平相关的死亡风险显著增加(P< 0.001)(图1a)。此外，即使在对传统心脏病风险因素(年龄、性别、吸烟、SBP、糖尿病、HDL和LDL)(校正模型1)(危害比[HR]，1.91; 95％CI：1.39-2.62; P <0.001)(图1b)和具有NTproBNP水平的eGFR(校正模型2)(HR，1.75; 95％CI：1.06-2.86; P = 0.027)调整后，升高的TMAVA水平(Q4)也是7年心脏死亡和移植风险的独立预测因子。

最近，我们发现肠道微生物群是内源性TMAVA生成的必要条件。肠道微生物群与赖氨酸2-单加氧酶(DavB)和5-氨基戊酰胺酶(DavA)酶从TML产生TMAVA(图1c)。无菌小鼠在血浆、粪便和尿液中都检测出TMAVA(图1d)。最近的研究发现，TML与发生(3年)主要不良心血管事件风险和发生(5年)死亡风险独立相关。因此，利用从表达DavB和DavA基因的大肠杆菌菌株中纯化的重组DavB和DavA蛋白，对TMAVA的产生进行了检测。当纯化的DavB和DavA蛋白与TML一起孵育时，体外时间依赖性地产生TMAVA(图1e)。此外，当来自传统饲养小鼠的粪便与不同浓度的TML共同孵育时，TMAVA水平也以时间和浓度依赖性方式增加(图1f)，而无菌粪便未能产生TMAVA。灌胃d9-TML时间依赖性地增加了小鼠血浆d9-TMAVA水平(图1g)，这表明前体/产物之间存在直接关系。先前的研究表明，TML可以生成TMAO。我们研究发现，在灌胃TML后，血浆中d9-TMAO水平仅略有上升。相比之下，d9-TMAVA的峰值水平明显高于d9-TMAO(图1g)，当将d9-TMAO灌胃至无菌小鼠或常规小鼠腹腔注射时，d9-TMAVA产生被抑制。这些结果直接证明口服TML可以优先作为TMAVA的前体，而不是体内TMAO。在Megablast搜索从NCBI下载的36,464个细菌基因组，发现粪肠球菌和铜绿假单胞菌的序列与davB和davA的同一性达到80％。当这些细菌与1 mM TML孵育时，TMAVA以时间依赖性方式产生(图1h)。总体而言，这些结果表明TML是肠道微生物群依赖性形成TMAVA的前体。更重要的是，在一个由53名HF和41名对照组成的独立队列中进行了宏基因组测序，我们发现HF患者肠球菌属水平显著升高，粪肠球菌属也增加。假单胞菌属水平和铜绿假单胞菌物种水平呈上升趋势，但无统计学差异(图1i，补充图1d)。

图1 血浆TMAVA水平升高与心源性死亡和移植风险相关，与传统风险因素无关。a Kaplan-Meier按队列中的TMAVA四分位数排列(N = 1647)评估7年心脏死亡和移植风险。b 森林图显示根据TMAVA四分位数的心源性死亡和移植事件(7年)风险的HR(95% CI)。c 通过DavB和DavA系统从TML生成TMAVA的模式。d 无菌小鼠(n =4)血浆、粪便和尿液中TMAVA水平显著降低。e 通过DavB和DavA系统从TML体外产生TMAVA (n=3)。f 将常规饲养小鼠的粪便与不同浓度的TML共同孵育，并检测TMAVA水平(n = 3)。g 用d9-TML处理小鼠。用稳定同位素稀释LC-MS (n = 2)在指定时间连续抽血，测定d9-TMAVA和d9-TMAO。h 粪肠球菌和铜绿假单胞菌与1 mM TML共同孵育，并在指定时间点检测TMAVA水平(n = 2和3)。i 使用宏基因组测序分析患者属水平的肠球菌和种水平的粪肠球菌丰度。通过双尾非参数Mann-Whitney检验[(d)和(i)]评估统计显著性。(*P < 0.05，** P < 0.01，***P < 0.001)。

2 TMAVA水平可预测各种慢性疾病亚组的HF风险，血浆TMAVA水平升高与心源性死亡和移植风险相关，与传统风险因素和TML无关

为了评估TMAVA与各种慢性病患者死亡风险之间的关联(对1647名患者进行84个月的随访)，我们分析了患有或不患有冠心病(n= 642, 39.0%)和糖尿病( n = 493, 29.9%)的患者(图2a, b)。 值得注意的是，在冠心病(P= 0.008)(图2a)和糖尿病(P  = 0.032)(图2b)患者中也发现了统计学意义(P < 0.05))，在这些亚组中，较高水平的TMAVA与不良结局风险增加有关。在该队列中，高血压患者(n =1359, 82.5%)的TMAVA水平越高，死亡风险也越高(图2c)。此外，45%的队列射血分数(EF)不低于40%，50.3%的射血分数降低(<40%)。其余参与者(4.7%)未进行评估。图2d表明，在EF定义的两个亚组的患者中，两组患者都表现出与TMAVA水平升高相关的显著较高的死亡风险。亚组(CHD或无CHD、糖尿病或无糖尿病、EF低或高、高血压或无高血压)之间的互作分析发现，不良结局与高血压或EF之间存在显著的相互作用。 据报道，作为TMAVA前体的血浆TML水平(图1f-h)与主要不良心血管事件风险(3年)和事件(5年)死亡风险独立相关。在我们的队列中，Kaplan-Meier对血浆TML水平的分析显示，随着分级的TML水平的增加，死亡风险逐渐增加，这在较高TML水平时尤为明显(P < 0.0001)(图2e)。我们还发现，与TML水平最低四分位数的受试者相比，最高四分位数(Q4)的患者发生心源性死亡和移植的风险显著增加(HR，2.14；95% CI：1.62-2.83；P <0.001)。此外，即使在对传统心脏风险因素(年龄、性别、吸烟、SBP、糖尿病、HDL和LDL)(校正模型1)(HR，2.15；95% CI：1.56–2.95；P  < 0.001)和具有NTproBNP水平的eGFR(校正模型2)(HR，1.72；95% CI：1.07–2.78；P  = 0.025)进行调整后，升高的TML(Q4)水平仍然是一个独立的预测因子(图2f)。 血浆TML和TMAVA水平升高均与心源性死亡和移植风险相关，与传统风险因素无关(图1和图2)。血浆TML与TMAVA水平显著相关(Spearman相关性r  = 0.40，P  < 0.001)(图2g)。此外，为了探索高TML水平是否与伴随TMAVA升高的未来心血管风险增加相关，我们发现当TML被添加到调整模型中时，升高的TMAVA (Q4)水平仍然是一个独立的预测因子(HR, 1.75；95% CI：1.07–2.87；P  = 0.026)(校正模型2，图2h)。

肠道微生物群衍生的代谢物TMAO正成为心血管风险增加的潜在因素。Kaplan-Meier分析显示，TMAO水平对心血管死亡和心脏移植的复合风险逐步增加。在调整风险因素(年龄、性别、吸烟、SBP、糖尿病、HDL、LDL、eGFR和NTproBNP)水平后，TMAO水平升高与HR显著增加相关(Q4与Q1：HR 1.78，95% CI：1.12– 2.82)，这与之前的研究一致。在调整TMAVA后，我们发现TMAO仍然与心源性死亡相关。尽管如此，在调整TMAO后，TMAVA仍然是一个独立的预测因子，这表明TMAVA和TMAO可能具有不同的代谢途径和作用。接下来，根据TMAVA和TMAO中值(<中值vs ≥中值)对患者进行分层。Kaplan-Meier生存图显示，与TMAVA和TMAO水平最低的患者相比，TMAVA和TMAO水平最高的患者发生HF的风险显著更高。

图2 TMAVA水平可预测各种慢性疾病亚组的心力衰竭风险，血浆TMAVA水平升高与心源性死亡和移植风险相关，独立于传统风险因素和TML。a–d Kaplan-Meier评估7年心脏死亡和移植风险，根据队列中冠心病(a)、糖尿病(b)、高血压(c)和EF(d)按TMAVA四分位数排列(N  = 1647)。e Kaplan-Meier评估7年心脏死亡和移植风险，按队列中TML四分位数排列(N  = 1647)。f 森林图显示根据TML四分位数的心源性死亡和移植事件(5年)风险的HR(95% CI)。g 验证队列中血浆TMAVA和TML水平之间的相关性(N = 1647)。h 森林图显示根据TMAVA四分位数的心源性死亡和移植事件(7年)风险的HR(95% CI)。

3 TMAVA 加重HFD和TAC引起的心肌肥厚和功能障碍

为了确定TMAVA代谢物对与代谢综合征相关的心肌肥厚和HF的具体贡献，小鼠接受或不接受TMAVA和HFD处理12周。12周后，血浆TMAVA水平显著升高(9.52μM vs. 113.5μM)。与未处理的对照组相比，TMAVA处理小鼠的心脏重量增加(图3a-c)，同时心肌细胞的横截面积显著增加(图3d-f)。此外，包括心房利钠肽和脑利钠肽(BNP)在内的肥大标志基因显著上调(图3g)。超声心动图评估显示，在TMAVA处理的HFD小鼠中，舒张期左后壁厚度、收缩期左室体积和左室质量进一步增加。TMAVA处理的小鼠EF和缩短分数(FS)进一步降低(图3h-j)。相应地，TMAVA处理的小鼠表现出运动能力显著降低(图3k)。为了研究TMAVA是否能在没有HFD的情况下引发心肌肥厚，小鼠还在饮食(CD)时，在饮用水中加入0.325% (m/v%) TMAVA。12周后，与未处理的对照组相比，TMAVA处理小鼠的心脏重量增加。超声心动图评估显示，TMAVA处理的CD小鼠左心室前壁(LVAW)、后壁(LVPW)厚度和LV质量均有所增加，但EF和FS保持不变，表明TMAVA处理12周后的CD小鼠的心脏功能仍处于代偿期。此外，在饮用水中加入TMAVA (m/v%) 处理2周的小鼠随后受到横向主动脉缩窄(TAC)诱导的LV压力超负荷。TMAVA处理组的心脏重量增加。超声心动图评估显示，TMAVA处理的小鼠EF和FS降低。这些数据表明，TMAVA可促进小鼠心肌肥厚，TMAVA联合HFD或TAC可加重心肌肥厚并促进心功能不全。

图3 TMAVA会加重高脂饮食中的心肌肥厚和功能障碍。给小鼠喂食HFD 12周，TMAVA组在[a - q]的饮用水中加入0.325% TMAVA (m/v %)，n = 5-8/组。a 接受TMAVA处理的小鼠心脏增大(左)，TMAVA组心脏大体形态沿心脏较短轴的切片显示心室尺寸和心室壁厚度增加(右)。b 在TMAVA处理的小鼠中，心脏重量与体重的比率显著增加(n = 5和7)。c TMAVA处理小鼠的心脏重量与胫骨长度的比率显著增加(n = 6/组)。d,e H&E (d)和小麦胚芽凝集素(WGA)染色(e)显示TMAVA处理的小鼠心肌细胞肥大。f 心肌细胞横截面积(CSA)的定量分析。在五个独立的心肌切片中，每只动物的100个肌细胞的CSA测量值确定了心肌细胞大小。g 相对于对照组(n = 5和7)，TMAVA处理的小鼠心脏心房利钠肽(ANP)和脑利钠肽(BNP)的mRNA水平。h 具有代表性的左心室超声心动图图像显示心室扩张和心功能不全。i,j 用超声心动图评估对照和TMAVA处理小鼠的射血分数(i)和缩短分数(j)。(n = 8和7)。k 对照组和TMAVA处理小鼠从跑步机运动到精疲力竭的距离(n = 6)。l，m 血浆TG (l)和FFA (m)水平(n = 7和8)。n 油红O染色显示TMAVA处理的小鼠心脏中的中性甘油三酯沉积增加。o TMAVA处理小鼠的心肌TG和FFA含量增加(n= 5 和7)。P TMAVA和HFD联合处理12周后进行比较心肌脂质组学(n = 6)。对照和TMAVA处理小鼠之间脂质水平的分层聚类分析热图。红色表示上调，蓝色表示下调。列和行分别代表实验心脏样本和脂质种类。q 对照和TMAVA处理小鼠中的DG种类分析。

4 TMAVA处理导致心肌脂质堆积

TMAVA联合HFD处理12周后，与对照组相比，血浆甘油三酯(TG)和FFA水平显著增加(图3l，m)。冷冻心脏切片的油红O染色表明在TMAVA处理的心脏中存在显著水平的脂滴，但在对照心脏中没有(图3n)。与该组织学观察结果一致，TMAVA处理的HFD样本中心肌TG和FFA的水平比对照HFD心脏高30%和20%(图3o)。此外，在TMAVA联合HFD处理12周后进行比较心肌脂质组学。主成分分析(PCA)显示，与对照相比，TMAVA处理的小鼠显示出脂质谱的显著改变。分层聚类分析热图表明，TG和甘油二酯(DG)升高(图3p)。具有脂肪毒性的中、长链FFA在心脏中也显著增加。DG被认为是通过蛋白激酶C的作用导致脂毒诱导胰岛素抵抗的代谢产物，我们发现在TMAVA处理的小鼠中DG种类增加(图3q)。

5 TMAVA抑制肉碱代谢并损害心肌能量稳态

TMAVA处理显著降低了血浆和心脏肉碱(图4a)。与循环肉碱的减少相一致，心脏中的所有酰基肉碱种类均显著减少，表明FAs β-氧化处于抑制状态(图4b)。肉碱是通过γ-丁基甜菜碱羟化酶(BBOX)对γ-丁基甜菜碱(γ-BB)进行羟基化而内源合成的。使用表面等离子共振，我们之前报道过TMAVA竞争性地抑制γ-BB与BBOX的结合，导致肉碱合成不足。在涉及HF患者(n=1647)和对照组(n= 1000)的横断面研究中，我们发现HF患者的TMAVA呈现增加趋势。重要的是，当人群进一步分为两组时，根据他们的γ-BB水平(低或高)，HF患者的TMAVA明显高于γ-BB水平较高的对照组。此外，与最低四分位数相比，血浆TMAVA最高四分位数与更高的HF几率相关(优势比[OR]，1.58；95% CI：1.12-2.23；P = 0.009)。模型1(针对年龄和性别进行调整)和模型2(针对模型1、吸烟状况、SBP、糖尿病、HDL、LDL和eGFR进行调整)的多变量调整OR(95% CI)分别为1.67(95% CI：1.17–2.38)和1.60 (95% CI: 1.00–2.56)。此外，我们发现血浆γ-BB显示随着γ-BB水平的分级而逐渐增加的死亡风险，特别是在Kaplan-Meier分析中的高四分位数(P  < 0.0001)。与处于γ-BB水平最低四分位数的受试者相比，处于最高四分位数(Q4)的患者发生心源性死亡和移植的风险显著增加(HR，2.61；95% CI：1.96-3.49；P < 0.001)。此外，即使在对传统心脏风险因素(年龄、性别、吸烟、收缩压、糖尿病、LDL和HDL)(校正模型1)(HR，2.66；95% CI：1.91-3.72；P  < 0.001)和具有NTproBNP水平的eGFR(校正模型2)(HR，1.78；95% CI：1.03-3.05；P  = 0.037)进行调整后，升高的γ-BB水平(Q4)仍然是一个独立的预测因子。此外，根据TMAVA和γ-BB中值(<中值与≥中值)对患者进行分层。Kaplan-Meier生存图显示，与TMAVA和γ-BB水平最低的患者相比，TMAVA和γ-BB水平最高的患者发生HF的风险显著更高。这些结果表明BBOX和γ-BB在HF中起重要作用。 由于肉碱是一种亲水性季胺，其被动渗透性非常低，肉碱/有机阳离子转运蛋白2 (OCTN2)是肉碱的高亲和力转运蛋白，分别有助于肾脏再吸收以及心脏和肝脏从循环中摄取肉碱。OCTN2水平在肾脏中最高，而心脏是第二丰富的组织。为了确定TMAVA是否抑制OCTN2介导的肉碱摄取，我们建立了稳定过表达人hOCTN2的MDCK细胞。在各种浓度的TMAVA存在下评估MDCK-hOCTN2细胞中d9-肉碱的摄取。在IC50为4.15 μM时，TMAVA以浓度依赖性方式减少d9-肉碱的摄取。100 μM浓度的TMAVA具有与100 μM米屈肼相当的抑制作用，100 μM是抑制肉碱转运的阳性对照。此外，我们发现TMAVA还浓度依赖性地抑制原代新生大鼠心室肌细胞(NRVM)中d9-肉碱的摄取，这证实了其对心脏肉碱摄取的潜在抑制作用(图4c)。我们还测量了人体心脏组织中的TMAVA水平，发现其与先前报告中发现的范围相当，三个随机HF心脏样本中的TMAVA浓度分别为33.8 µM、7.99 µM和2.4 µM。这些数据表明，TMAVA可以通过同时抑制心脏组织中的BBOX(合成)和OCTN2(摄取)来抑制肉碱代谢，导致心肌脂质积累达到病理生理水平。

利用蛋白质组学发现TMAVA处理后心脏中蛋白丰度和调控蛋白富集途径的变化。与HFD对照组相比，TMAVA处理的小鼠出现了蛋白质组谱的显著改变。共检查了2638种心脏蛋白，其中457种蛋白质的丰度发生了显著变化。心脏蛋白质组的生物过程分析显示，显著调节的蛋白质富集在氧化还原和代谢过程中。参与TCA循环的酶上调。GO细胞成分的富集分析还揭示了蛋白质主要定位在线粒体中。功能聚类分析显示，显著变化的蛋白质主要与能量代谢(线粒体和FAO)有关。为了确认改变的FAO，测量了相对基因表达。在TMAVA处理小鼠的心脏组织中，FAO基因的表达增加，包括肉碱棕榈酰转移酶(CPT)1α、CPT1β、长链酰基辅酶A脱氢酶(ACADL)和极长链酰基辅酶A脱氢酶 (ACADVL)。TMAVA处理的小鼠显示FA合酶(FASN)的脂肪生成基因表达受到抑制，可能以代偿方式。这些数据表明，TMAVA处理改变了线粒体中FA代谢的蛋白质谱。

图4 在TMAVA处理后，脂肪酸氧化(FAO)受到抑制，心肌线粒体功能失调。给小鼠喂食HFD 12周，在[(a, b)和(d)-(i)]的饮用水中添加0.325% TMAVA (m/v%)。a TMAVA处理降低了血浆(左)(n = 11)和心脏(右)(n = 6)中的肉碱含量。b 心脏中的酰基肉碱水平降低。通过LC-MS ( n  = 5)检测心脏个体酰基肉碱种类。c 在5和50 μM TMAVA ( n = 6/浓度)存在下检测原代新生大鼠心室肌细胞(NRVM)对d9-肉碱的摄取。d 使用3H-棕榈酸(n = 4)在对照和TMAVA处理的小鼠中检测心脏脂肪酸β-氧化活性。e 用电子显微镜观察HFD喂养12周的对照组和TMAVA处理小鼠的心脏。f 使用ImagJ ( n = 6)计算脂滴百分比(占总图像面积的百分比)。g HFD 12周后从WT小鼠和TMAVA处理小鼠分离的心脏线粒体的呼吸速率。h 使用氧化剂敏感探针二氢乙锭(DHE)(红色)检测心肌组织ROS水平。细胞核用DAPI(蓝色)复染。i DHE染色(红色)荧光强度的量化(n = 6/组)。

6 经TMAVA处理的心脏FAO受损

为了研究TMAVA处理是否影响HFD条件下的心肌能量代谢，我们评估了两组小鼠的FAO发生率。TMAVA处理小鼠线粒体FAO减少(图4d)。在跑步机耗竭测试中，可能是由于在TMAVA处理后，作为非耦合线粒体呼吸的能量底物的FFA氧化量不足，TMAVA处理的小鼠FFA和FFA/甘油摩尔比升高。TMAVA处理的小鼠在运动后也显示葡萄糖水平显著下降，这表明葡萄糖作为替代能量底物的使用可能得到增强。此外，心肌细胞的超微结构分析表明，在TMAVA处理的小鼠中(图4e)，线粒体肿胀，电子密集体减少，脂滴积累增加(图4f)。我们还检查了从对照和TMAVA处理的小鼠中分离出的线粒体呼吸频率。发现来自TMAVA处理的小鼠心脏线粒体表现出呼吸链缺陷，使用棕榈酸作为底物的最大线粒体呼吸(MMR)降低，表明线粒体呼吸严重受损(图4g)。TMAVA处理组的线粒体体积也增加。蛋白质印迹结果表明，在TMAVA处理后，线粒体复合物(CI亚基NDUFB8、CII亚基SDH、CIII亚基UQCRC和CV亚基ATP5A)显示出丰度增加的趋势。在TMAVA处理的小鼠中，心肌组织活性氧(ROS)水平增加(图4h，i)。在TMAVA处理的小鼠中，血浆氧化应激标志物8-异前列腺素也增加。因此，在HFD条件下，TMAVA处理和脂质积累与FAO减少和小鼠心脏氧化应激增加有关。

7 BBOX失活模拟了TMAVA处理

为了提供BBOX是TMAVA诱导FAO损伤的分子靶点的遗传证据，通过CRISPR-CAS9介导小鼠BBOX基因外显子2的缺失产生了BBOX缺陷小鼠。我们发现，与HFD处理12周的对照小鼠相比，BBOX敲除小鼠的心脏形态增加(图5a)。与TMAVA处理相比，血清TG和FFA含量升高(图5b与图3l，m)。H&E、WGA和油红O染色显示BBOX-/-小鼠心脏中的心肌细胞肥大和中性脂质沉积增加(图5c)，这与TMAVA处理一致(图3)。与组织学观察结果一致，HFD BBOX-/-小鼠的心肌TG和FFA水平比HFD WT小鼠高40%和30%(图5d)。此外，在HFD处理12周后，对两组进行比较心肌脂质组学。与WT对照相比，BBOX-/-小鼠显示出脂质谱显著改变。我们发现，与WT对照相比，BBOX敲除心脏中的TG、DG、FA、LPE、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)增加，而磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)降低。中等和长链FFA在心脏中也显著增加。在BBOX-/-小鼠中，发挥心脏脂毒性的DG种类也有所增加(图5f)。

心肌细胞的超微结构电子显微镜分析表明，BBOX缺陷小鼠中的线粒体肿胀，脂滴积累增加。我们还发现，从BBOX-/-小鼠分离的线粒体表现出呼吸链缺陷和MMR降低，并且使用棕榈酸作为底物，表明这些小鼠的线粒体呼吸严重受损(图5g)。BBOX-/-组的线粒体体积也增加。与增加的线粒体体积一致，线粒体复合物的相对量(CI亚基NDUFB8、CII亚基SDH、CIII亚基UQCRC和CV亚基ATP5A)在BBOX-/-小鼠中显示出丰度增加的趋势。通过mtDNA编码基因mt-cytb(编码细胞色素b)的定量PCR测量，mtDNA含量增加。因此，BBOX-/-小鼠的心肌组织ROS水平升高(图5h，i)，参与氧化应激的心脏基因(NOX4、gp91phox、p22phox和p47phox)的mRNA水平也升高(图5j))。BBOX-/-小鼠的血浆氧化应激标志物8-异前列烷也增加(图5k)。敲除小鼠的EF和FS进一步降低(图5l，m)。总之，这些结果表明，BBOX-/-小鼠重现了用TMAVA处理的小鼠的表型，这表明TMAVA通过BBOX引起心脏脂质积累和肥大。

图5 BBOX缺乏会导致心肌肥厚、脂质积累和氧化应激。WT(对照)和BBOX缺陷型(BBOX-/-)小鼠在[(a - m)]中喂食HFD 12周。a 与对照相比，BBOX-/-小鼠心脏的大体形态显示增大。b 禁食16小时后测量血浆TG和FFA水平(n = 6和7)。c H&E(左)、WGA(中)和油红O(右)染色显示BBOX-/-小鼠心脏中的心肌细胞肥大和中性甘油三酯沉积增加。d BBOX-/-小鼠的心肌TG和FFA含量增加(n = 6和7)。e 对照和BBOX-/-小鼠(n = 6)之间指示脂质差异水平的分层聚类分析热图。红色表示上调，蓝色表示下调。列和行分别代表实验心脏样本和脂质种类。f 对照组和BBOX -/-小鼠中的DG种类(n = 6)。g 在用HFD处理12周后，从WT小鼠和BBOX-/-小鼠分离的心脏线粒体的呼吸速率。h 使用氧化剂敏感探针二氢乙锭(DHE)(红色)和DAPI(蓝色)对细胞核进行复染检测心肌组织ROS水平。i DHE(红色)荧光强度的量化(n= 6/组)。j 参与氧化的心脏基因(Nox4、gp91phox、p22phox和p47phox)的mRNA水平的RT-qPCR(n = 6和8)。k 在HFD处理12周后测量血浆氧化应激标志物8-异前列烷(n = 7和8)。l,m 在HFD处理12周后通过超声心动图评估对照组和BBOX-/-小鼠射血分数(l)和缩短分数(m) (n = 6和7)。

8 外源性肉碱补充可逆转TMAVA诱导的心肌肥厚

为了检查补充肉碱是否可以逆转TMAVA诱导的心肌肥厚，我们用TMAVA处理WT小鼠，在其饮用水中加入或不加肉碱。肉碱补充剂显著逆转了TMAVA诱导的心脏肉碱减少(图6a)。TMAVA在心肌肥厚和脂质含量中的病理作用被肉碱补充消除，心脏重量/胫骨长度和TG水平证明了这一点(图6b，c)，这与没有TMAVA处理的对照小鼠类似(图3c与图6b)。H&E、WGA和油红O染色显示，在肉碱处理的小鼠中，心肌细胞肥大消失，中性脂质沉积减少(图6d)。肉碱补充组中心肌TG和FFA的水平也降低了20%，与HFD中未经TMAVA处理的对照小鼠类似(图3o与图6e)。在肉碱处理的小鼠中线粒体FAO也增加(图6f)。与组织学观察一致，超声心动图评估显示，与仅TMAVA组相比，肉碱组的EF和FS也逆转(图6g，h)，尽管与单独使用HFD的组相比，肉碱组的EF和FS较低(图3i、j与图6g、h)。因此，外源性肉碱补充可以逆转TMAVA诱导的心肌肥厚。

图6 外源性肉碱补充可逆转TMAVA诱导的心肌肥厚。TMAVA处理小鼠[饮用水中0.325% (m/v %)]。在[(a – h)]中，小鼠在饮用水中喂食含有或不含0.325%肉碱(m/v %)的HFD，持续12周。a 处理12周后测量心脏组织中的肉碱水平(n = 6)。b 肉碱处理组(TMAVA+Car)的心脏更小(左)，心脏重量与胫骨长度的比值(右)显著降低(n = 6/组)。c 补充肉碱的小鼠血浆TG降低(n= 7)。d H&E(左)、WGA(中)和油红O(右)染色显示用TMAVA + Car处理的小鼠心脏心肌细胞肥大减少，中性甘油三酯沉积减少。e 肉碱处理组心肌TG和FFA含量降低(n = 6)。f 使用3 H-棕榈酸( n = 6)在对照和TMAVA处理和TMAVA + Car处理的小鼠中离体测定心脏脂肪酸β-氧化活性。g,h 通过超声心动图评估在TMAVA和TMAVA+Car处理小鼠12周后射血分数(g)和缩短分数(h) (n= 6)。i 概述TMAVA促进心肌肥厚的可能途径。TMAVA通过微生物群从TML代谢而来。TMAVA与γ-BB竞争结合BBOX，并抑制肝脏中γ-BB的内源性肉碱合成以及肾脏和心脏中OCTN2的摄取。肉碱水平降低会抑制FFA氧化，导致心肌脂质积累。随后，脂毒性导致过度氧化应激和线粒体功能障碍。随着FFA氧化被抑制，葡萄糖代谢可能会出现代偿性增加。病理性代谢导致心肌肥厚并最终发展为HF。

讨论

本研究表明，TMAVA是一种微生物产生的代谢物，可加速心肌肥厚。结果表明：(1)在HF队列中，较高的TMAVA水平伴随着心脏死亡风险增加；(2)在心衰患者中粪肠球菌的水平升高；(3) TMAVA处理小鼠在HFD中表现出心肌肥厚和功能障碍加重；(4) TMAVA抑制肉碱合成和摄取，导致心肌FAO抑制和脂质积累；(5) TMAVA处理导致心脏线粒体功能障碍；(6) BBOX缺乏抑制FAO，导致心肌脂质蓄积，表明TMAVA通过BBOX发挥作用；(7)外源性肉碱补充可逆转TMAVA诱导的心肌肥厚。综上，这些结果表明，肠道微生物群衍生的TMAVA通过抑制肉碱合成和随后的FFA氧化，是心肌肥厚发展的关键决定因素。TMAVA可能是HF患者二级预防的治疗靶点(图6i)。 HF与肠道中病原菌和真菌水平的大量增加以及肠道通透性和炎症的增加有关。先前的研究发现，肠道中的病原菌菌落与HF的严重程度有关。与健康个体相比，HF患者的病原菌菌落较多。

此外，心力衰竭患者肠道内病原菌过度生长，导致慢性肠壁和全身炎症，导致肠道通透性增加。另一方面，来自肠道微生物群的特殊代谢物与宿主代谢协同作用。先前的研究发现，当与包括肾功能调整在内的临床风险评分相结合时，微生物代谢物TMAO有助于预测急性HF住院死亡率的风险。这些数据为肠道微生物群在心脏病发病机制中的重要性提供了证据，并提出了肠道-心脏轴。本研究发现TMAVA是由肠道微生物群通过TML产生的(图1f-h)。更重要的是，与TMAVA最低四分位数的受试者相比，最高四分位数的患者HF预后明显更差。在对传统心血管疾病(CVD)风险因素、eGFR进行调整后，血浆TMAVA水平升高仍然是HF风险的重要独立预测因子(图1a、b)。此外，我们发现eGFR与血浆中TMAVA的四分位数呈负相关，这表明TMAVA可能是肾功能的读数，而肾功能又是HF的独立风险因素。然而，在eGFR调整后TMAVA仍然显著，表明血浆TMAVA水平升高与心衰患者的心源性死亡和移植风险相关，与肾功能无关。由于TMAVA也是一种容易被肾脏过滤的低分子量化合物，因此TMAVA水平升高可能是由于肾功能下降，我们还观察到eGFR与血浆中TMAVA的四分位数呈负相关。之前的几项研究表明，慢性肾病患者的肠道微生物群发生了变化，以及在这种情况下肠道屏障功能发生了改变。因此，肠道代谢增加和TMAVA吸收可能导致肾功能受损患者的TMAVA浓度升高是合理的。未来，应开展更多旨在调查TMAVA对肾功能影响的基础研究，以及专门设计用于检验TMAVA对肾病患者心血管预后价值的大规模横断面研究。 最近，Li及其同事使用非靶向代谢组学方法发现了与CVD风险相关的血浆代谢物TML。TML水平与(3年)主要不良心血管事件风险和(5年)死亡风险相关，且独立于传统的心血管风险因素。TML是动物和植物中的相对丰富的蛋白质翻译后修饰。它存在于多种动物和植物物质中，可作为肠道微生物依赖的三甲胺(TMA)生成的营养前体，并随后在肝脏中转化为TMAO。本研究发现，TML水平与较高水平的死亡风险逐渐增加相关，这与之前的研究一致。然而，Li等人表明，来自小鼠和人类(杂食动物和素食主义者)的粪便培养物促进TML向TMA的转化，尽管转化潜力较低。此外，与长期膳食胆碱摄入不同，在小鼠中补充TML未能提高血浆TMAO。在这项研究中，我们发现TMAVA在体内从TML代谢时显示出比TMAO显著(50到100倍)更高的峰值水平(图1g)。这些结果直接表明口服TML可以优先作为来自微生物群的TMAVA前体，而不是体内的肝脏TMAO。更重要的是，我们发现当将TML添加到校正模型中时，升高的TMAVA(Q4)水平仍然是一个独立的预测因子(图2h)。这些结果表明，TMAVA(而非TMAO)可能是TML的主要代谢物，可能在CVD和HF中起重要作用。 FAO受损会导致脂质过度积累，称为脂毒性心肌病，导致心脏功能障碍。有人认为，患有2型糖尿病、代谢综合征和肥胖症的患者会积累过多的心肌内脂质并表现出收缩或舒张功能下降。在我们的研究中，线粒体FAO在TMAVA处理的心脏中受损(图 4d)，可能是由于同时存在TMAVA依赖性抑制BBOX (导致细胞内肉碱合成减少)和OCTN2抑制(导致摄取受损)的综合作用。此外，我们发现TMAVA可以驱动CD小鼠的心肌肥厚，尽管心脏功能处于代偿阶段。当与TAC或HFD同时存在时，TMAVA会加剧心脏功能障碍。这让人联想到在非酒精性脂肪肝模型和保留EF的HF模型中提出的双重打击效应。 TMAVA依赖的FAO减少导致心肌脂质积累(图3n，o)。

此外，心肌内脂质积累与非缺血性HF患者心脏组织的收缩功能障碍相关。脂质组学的质谱评估显示，与相应的对照心脏相比，TMAVA处理小鼠和BBOX-/-小鼠心脏中的DG含量显著升高(图3q和图5f)。先前的一项研究报告称，DG通过蛋白激酶C(PKC)的作用被认为是脂毒性诱导的胰岛素抵抗的致病代谢物。PKC下游信号通路参与细胞凋亡、胰岛素抵抗、自噬和病理性心肌肥厚的发展。GPCR激动剂增加DG的产生，导致心肌细胞中持续的PKC激活。过量的DG还会激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX2)。NOX2衍生的ROS可通过JNK通路促进FFA诱导的胰腺β细胞功能障碍。与这些发现一致，通过DHE染色发现NADPH氧化酶活性显著更高，导致超氧化物生成增强。线粒体ROS生成的增强会减少线粒体呼吸和ATP合成。众所周知，线粒体是ROS的主要来源。我们的研究发现，TMAVA处理和BBOX-/-小鼠的心肌组织ROS水平升高，氧化心脏基因(Nox4、gp91phox、p22phox和p47phox)的mRNA水平也升高，表明过度氧化应激(图4h和图5h-j)。脂毒性还引起线粒体外膜的通透性增加，导致线粒体的生物能量和氧化还原功能停止。脂质过载还增加了AKAP121泛素化、调节DRP1磷酸化和改变OPA1加工。ROMO1(ROS调节剂1)是一种线粒体蛋白，也是一种氧化还原敏感因子，通过影响OPA1裂解和寡聚化来调节线粒体形态。事实上，在TMAVA处理和BBOX-/-小鼠中，线粒体呼吸严重受损(图4g和图5g)。这些结果表明，TMAVA处理会导致氧化应激和线粒体结构和功能改变。 在真核生物和原核生物中，内源性肉碱生物合成的限速步骤涉及BBOX对γ-BB的羟基化以产生肉碱。另一方面，肉碱可以代谢为γ-BB，但只能通过肠道微生物群，而γ-BB可以进一步裂解产生TMA。这是两种不同的代谢途径。前者有助于能量代谢并有利于健康，后者有助于肠道中TMAO生物合成，后者显示出促炎作用，导致疾病发病机制，包括动脉粥样硬化性CVD、代谢综合征等。在人类中，这两种途径之间的平衡影响健康。我们的研究发现，TMAVA与γ-BB 竞争结合BBOX，从而抑制肉毒碱的合成(图4a，b)。此外，TMAVA可以通过 OCTN2有效抑制心肌细胞对肉碱的摄取(图4c)。最近的一项研究还发现，在接受TAC的小鼠中，使用腺相关病毒载体过表达OCTN2可显著改善EF并减少间质纤维化，这强调了OCTN2在心脏代谢中的重要作用。随着肉碱缺乏，循环中的酰基肉碱种类也显著减少，表明FAO受到抑制。

我们发现HFD加重了TMAVA引起的心功能不全，在我们的总体研究结果中，这主要归因于HFD 增加了心脏中的FA来源，以及由于TMAVA处理导致肉碱代谢减少，FAO被抑制。FAO是成年哺乳动物心脏的主要能量来源。对葡萄糖依赖增加的FAO减少是病理性心肌肥厚中发生的代谢重塑标志，并且与心肌能量降低和心脏功能受损有关。肉碱通过促进由CPT催化的酰基肉碱分子的运输，在FAO中发挥着不可或缺的作用。患有全身性肉碱缺乏症的患者患有严重的心肌病，与肉碱水平降低有关，而口服肉碱补充剂可以显著减小心脏大小并缓解心肌病。肉碱也是一种抗氧化剂，可作为自由基清除剂保护细胞免受ROS的侵害。肉碱治疗已被证明可以预防缺血再灌注损伤并提高CVD患者的运动耐量和活动水平。 本研究发现外源性肉碱补充可逆转TMAVA诱导的心肌肥厚，表明肉碱的可用性对心脏代谢至关重要。然而，肉碱的心脏保护功效的证据是有争议的。最近的研究发现，肠道微生物群对膳食肉碱的代谢，导致TML和TMA，从而促进TMAO的产生，加重动脉粥样硬化。此外，肠道微生物群似乎通过促进TMAO的产生，在解释膳食肉碱和CVD之间明显的不良后果方面起着至关重要的作用。一致地，血浆肉碱水平预示着发生重大心脏不良事件的风险增加，但仅限于TMAO水平也升高的个体。杂食性个体在受到氘标记肉毒碱的挑战时比纯素食者或素食者产生更多的TMAO，并且临床研究比较个体在口服抗生素混合物治疗之前和之后的结果表明，完整的肠道微生物群在饮食中肉碱在人体中转化为TMAO起着必不可少的作用。有趣的是，粪便中属于梭状芽孢杆菌科和消化链球菌科的微生物类群的比例与杂食性饮食模式和人类血液中 TMAO水平呈正相关，因此推测这些类群可能参与了肉碱在肠道中转化为TMA。小鼠的不同遗传背景和设施环境显示了微生物群的差异。达到了与在人类种群中观察到的相当程度的多样性，即使对于遗传自交系也是如此。为了系统地解决这些微生物驱动的宿主表型，未来的研究应该依赖于微生物组研究的标准化和标准化的新兴技术结合药代动力学研究。它们的建立应该解决特定细菌群落通过不同途径对补充肉碱对TMAO和TMAVA之间平衡影响的个体贡献，以及随之而来的对心脏代谢疾病的影响。尽管这些与临床应用相关，最近的一项研究还发现，与口服途径相比，肉碱肠外给药对TMAO水平没有明显影响，对HFD喂养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变进展没有不利影响。皮下给药肉碱可避免微生物代谢，并且在动脉粥样硬化方面是安全的。此外，肠胃外给药的肉碱生物利用度高于口服给药(100% vs. 5-18%)。因此，尽管肉碱对心脏代谢至关重要，但不同的肠道微生物群组成可能会增强肉碱产生促动脉粥样硬化性TMAO并增加CVD风险。这可能具有重要的临床意义。在CVD高风险患者中，例如接受维持性血液透析的终末期肾病患者，必须常规补充肉碱。对于这些患者，肠胃外给药，而不是口服给药，可能是首选方案。同样，肉碱的肠胃外给药可能对预防心脏病患者的TMAVA相关心脏重塑和HF产生重大影响。

总之，值得注意的是，大规模流行病学研究已经注意到肠道微生物群、脂毒性和HF风险增加之间的关系。本研究揭示了临床相关发现，肠道微生物群通过生成TMAVA，可能参与调节心肌肥厚和最终进展为HF。

因此，这些结果揭示了潜在的治疗靶点和对心肌肥厚的营养干预改进。具体而言，本研究表明，将肠道微生物TMAVA通路作为一种治疗策略有可能缓和与TMAVA升高相关的心肌肥厚进展，无论是通过饮食、益生菌或益生元改变微生物群落，或直接对参与TMAVA合成的微生物酶进行药理学抑制。解决这种可能性的研究代表了一个有吸引力的未来研究领域。因此，发现TMAVA生成、肠道微生物群代谢和HF风险的联系可能对健康有重要意义。 

打赏