科研丨CANCER RES: 肠道微生物群的破坏导致上皮性卵巢癌对顺铂产生耐药性

导读  

上皮性卵巢癌(EOC)是妇科癌症死亡的主要原因。尽管对干预有初步反应，但高达80%的患者肿瘤复发并需要额外的治疗。对OC患者的回顾性临床分析表明，化疗期间使用抗生素与较差的总生存率有关。本研究评估了抗生素（ABX）治疗是否会影响EOC的生长和对顺铂的敏感性。在腹腔注射EOC细胞之前，给免疫正常或免疫缺陷小鼠提供未经处理的对照组或含有ABX的水(甲硝唑、氨苄青霉素、万古霉素和新霉素)，并每两周进行一次顺铂治疗，直到终点。与对照处理相比，ABX治疗的荷瘤小鼠表现出肿瘤生长加速和对顺铂治疗产生耐药性。ABX治疗导致顺铂治疗肿瘤中细胞凋亡减少，DNA损伤修复增加，血管生成增强，并且ABX治疗小鼠的肿瘤中含有比对照小鼠更高频率的顺铂增强肿瘤干细胞。粪便分析表明，ABX治疗破坏了非耐药性肠道微生物物种。来自对照处理小鼠的盲肠微生物群移植足以改善ABX治疗小鼠的化疗耐药性并延长其生存期，表明其具有肠源性肿瘤抑制作用。代谢组学分析确定了循环肠道衍生代谢物，这些代谢物因ABX治疗而改变，并通过再定植而恢复，提供了介导肠道微生物组和卵巢癌之间相互作用的候选代谢物。综上，这些结果表明，完整的微生物组在EOC中起肿瘤抑制作用，ABX治疗对肠道微生物群的扰动促进肿瘤生长并抑制顺铂敏感性。  

论文ID

原名：Disruption of the gut microbiota confers cisplatin resistance in epithelial ovarian cancer

译名：肠道微生物群的破坏导致上皮性卵巢癌对顺铂产生耐药性

期刊：Cancer Research

IF：13.312

发表时间：2022.10

通讯作者：Ofer Reizes

通讯作者单位：美国克利夫兰诊所Lerner研究所

DOI号：10.1158/0008-5472.CAN-22-0455

实验设计

结果

1 抗生素治疗的小鼠EOC肿瘤生长加速，对顺铂的敏感性减弱    

我们测试了这样一个假设：抗生素驱动的微生物组破坏会影响EOC的肿瘤发展和化疗敏感性。为此，我们实施了以下研究范式（图1A），其中向6周龄的C57BL/6J雌性小鼠提供水或含抗生素的水（ABX；氨苄青霉素、新霉素、甲硝唑和万古霉素），在研究期间持续提供。2周后，小鼠腹腔注射（IP）与BL/6小鼠同源的小鼠EOC细胞系ID8或ID8-VEGF。在研究期间，每周通过经腹超声(TAUS)监测肿瘤生长。ID8和ID8-VEGF细胞系被用于研究，因为它们具有高度特征性，并密切再现了人类卵巢癌的进展。ID8-VEGF细胞系略严重一些，可引起血管生成增加和腹水发展的增加。在肿瘤细胞注射后2周，每周给小鼠腹腔注射顺铂或赋形剂。小鼠的研究终点为肿瘤负荷达到>150mm3或人道终点(包括导致衰弱的腹水)。与对照组相比，ABX处理小鼠中ID8和ID8-VEGF EOC肿瘤生长显著增加(分别图1b和C)。此外，在ABX存在的情况下，顺铂治疗的疗效与对照治疗的小鼠相比减弱，表明发生了顺铂耐药性(图1B和C)。与对照组相比，ABX治疗组的中位生存期降低(图1D和E)。在ID8队列中，ABX安慰剂组和顺铂组的中位生存期分别为66天和64天，而H2O安慰剂组和顺铂组分别为68.5天和84天(图1D)。在ID8-VEGF小鼠队列中，ABX安慰剂组和顺铂组的中位生存期分别为39天和34天，而H2O安慰剂组和顺铂组的中位生存期分别为42天和53天(图1E)。ID8-VEGF小鼠比ID8队列的小鼠更早达到终点。

尸检时，通过H&E染色的组织切片以及良性相邻网膜的组织学评估来确认EOC肿瘤表型（图1F）。我们对来自ID8 H2O +顺铂和ABX+顺铂队列的ID8肿瘤进行了53BP1免疫荧光分析，发现与ABX队列相比，在H2O队列中53BP1升高(图1F)。与这些发现一致，我们发现与ABX顺铂组相比，H2O顺铂组的TUNEL染色有所增加（图1G）。这些结果与顺铂治疗的H2O组中DNA损伤的增加相一致，而在顺铂治疗的ABX小鼠中这一现象被削弱了（图1G）。为了验证组织学结果，并进一步建立ABX小鼠肿瘤生长和化疗耐药性增加的机制，我们对53BP1、BRCA1和CD31(血管生成)进行了qRT-PCR。我们发现与H2O顺铂队列的肿瘤相比，ABX顺铂治疗小鼠的肿瘤中53BP1受到抑制（图1H）。与H2O顺铂队列的肿瘤相比，ABX顺铂治疗小鼠的肿瘤中BRCA1表达增加（图1H），表明DNA损伤修复增加。此外，我们发现，与H2O顺铂队列的肿瘤相比，ABX顺铂治疗小鼠的肿瘤中CD31表达增加（图1H）。综上所述，我们的结果表明ABX治疗通过抑制细胞凋亡、增加DNA损伤修复和增强血管生成来促进肿瘤生长。

图1 无论顺铂治疗与否，ABX治疗的BL/6小鼠的肿瘤生长增加，中位生存期降低。

A.研究设计的示意图，强调了治疗模式。B和C.未用或用顺铂治疗的H2O和ABX C57BL/6J小鼠中ID8和ID8-VEGF肿瘤生长动力学。D和E.未用或用顺铂处理的H2O和ABX C57BL/6J小鼠中ID8和ID8-VEGF生存动力学分析。在两个队列中，顺铂治疗(虚线)增加了H2O治疗小鼠的生存率(黑色，ID8 p<0.01)，但没有改变ABX治疗小鼠的生存率(红色)。F.对H2O+顺铂或ABX+顺铂处理的ID8细胞注射小鼠的肿瘤进行53BP1染色以评估DNA损伤和H&E。显示代表性切片。G. 对来自H2O+/-顺铂或ABX+/-顺铂小鼠的肿瘤进行TUNEL染色以检测细胞凋亡。H. 收集H2O+顺铂或ABX+顺铂小鼠的肿瘤，对53BP1、BRCA1和CD31进行qRT-PCR分析。（n = 4, *p<0.01）。    

2 广谱抗生素对EOC腹水免疫人群的影响有限    

大多数EOC患者表现为晚期疾病(Ⅲ期或Ⅳ期)，可能包括腹水。既往研究报道，在腹水中发现的NK细胞和巨噬细胞等免疫细胞可能在肿瘤细胞的侵袭和生长中发挥关键作用。我们通过流式细胞术分析了腹水中的免疫细胞群。我们的分析侧重于骨髓细胞群和淋巴细胞群。在C57Bl/6J ID8-VEGF队列中，无论有无顺铂治疗，ABX治疗后的小鼠腹水中没有观察到骨髓细胞或淋巴细胞群的显著差异。当患者持续出现腹水时，对ID8-VEGF细胞进行分析。此外，在终点时，在收集的脾细胞或骨髓中，骨髓细胞群或淋巴样细胞群之间没有显著差异。    

3 破坏免疫系统对抗生素治疗小鼠的EOC肿瘤加速生长或顺铂敏感性降低没有明显影响    

为了评估ABX治疗后观察到的肿瘤生长和顺铂耐药的增强是否依赖于完整的免疫系统，在NSG免疫缺陷小鼠中利用了同样的研究范式。与H2O C57BL/6J队列相比，接种ID8或ID8-VEGF并接受ABX治疗的NSG队列显示出加速的肿瘤生长和更快的起效，而顺铂没有益处（图2A，C）。在ID8队列中，肿瘤进展的时间加快，对中位生存期的影响更加显著，ABX安慰剂和顺铂组的中位生存期分别为41天和45天，而H2O安慰剂和顺铂组的中位生存期为55天和69天（图2B）。在接种ID8-VEGF的NSG小鼠中也观察到类似的总生存率降低（图2D）。通过流式细胞术分析在终点收集的腹水。NSG小鼠具有未成熟的T细胞、DCs和巨噬细胞，但具有功能性中性粒细胞。ID8-VEGF队列中的NSG小鼠在各治疗组中均出现腹水，但骨髓细胞群无显著变化。综上所述，研究结果表明ABX治疗影响小鼠EOC荷瘤小鼠的动力学和总体生存期。    

图2 无论顺铂治疗与否，ABX治疗NSG小鼠的肿瘤生长增加，中位生存期降低。

在C57 BL/6 小鼠中注射ID8(A)和ID8 VEGF(C)细胞后，无论顺铂治疗与否，抗生素治疗的小鼠都表现出肿瘤生长增加。与H2O处理小鼠（黑色）相比，抗生素处理的ID8（B）和ID8 VEGF（D）注射NSG小鼠（红色）的中位生存期显著降低。此外，在任一队列中，顺铂治疗（虚线）增加了H2O处理小鼠的存活率（黑色，ID8＜0.01），但没有改变ABX处理小鼠的存活率（红色）。    

4 ABX治疗导致C57BL/6J和NSG EOC荷瘤小鼠的肠道微生物组发生类似破坏    

本研究使用的ABX治疗方案已被证明足以耗尽可检测到的共生细菌。然而，为了确定肠道微生物组对广谱抗生素治疗的应答，我们在基线、2周、顺铂开始用药、5周和终点尸检时收集粪便，并进行16S rRNA基因测序。我们分析了以下队列的微生物组：C57Bl/6J ID8、C57Bl/6J ID8-VEGF,、NSG ID8和NSG ID8-VEGF。    

4.1 C57BL/6J队列    

在ID8和ID8-VEGF BL/6队列中，每个治疗组有5只小鼠的粪便样本，通过对16S rRNA基因测序，总共获得了2,801,471和2,411,554条高质量的可用reads，平均长度为210个碱基对（bps）。所有ID8和ID8-VEGF BL/6样本中，有3,184个扩增序列变异(ASVs)。在ID8和ID8-VEGF队列中的配对比较显示，通过香农多样性指数（ANOVA）的分析，不同时间集合之间的α多样性存在统计学显著差异。此外，在ID8和ID8-VEGF队列中，基于Bray-Curtis差异的β多样性比较在p=0.003和p=0.001时具有显著性。无论顺铂治疗与否，抗生素治疗组的粪便微生物群落多样性明显低于对照组。具体来说，在抗生素治疗的ID8组中，一些Proteobacteria （包括Enterobacteriaceae和Parasutterella）的相对丰度增加，而在抗生素治疗的ID8-VEGF组中，Enterobacteriaceae丰度增加（图3A，B）。作为革兰氏阴性菌和大多数兼性厌氧菌，Proteobacteria通常对万古霉素具有抗性，而万古霉素主要影响革兰氏阳性菌；Proteobacteria对甲硝唑也不太敏感，而甲硝唑主要影响厌氧菌。此外，Enterobacteriaceae有多种抗生素耐药基因，允许其在整个ABX治疗过程中存活。Parasutterella的丰度增加与肠道微生物组的失调有关，但这种关联背后的机制还没有被完全阐明。    

4.2 NSG队列    

在ID8和ID8-VEGF NSG队列中，每个治疗组有5只小鼠的粪便样本，通过对16S rRNA基因测序，总共获得了4,784,498和2,822,423条高质量和可用的reads，平均长度为210个碱基对。在所有ID8和ID8-VEGF NSG样本中，有6484个ASVs。与BL/6队列一样，配对比较显示ID8和ID8-VEGF队列的收集时间点之间的α多样性差异具有统计学意义。此外，在ID8和ID8-VEGF队列中，采集时间点之间基于Bray-Curtis差异的β多样性在P=0.001时显著。此外，Paenibacillus和Enterococcus也有明显的相对增加(图4A, B)。

图3 ABX治疗导致C57BL/6小鼠肠道微生物组随时间推移发生微生物改变。

经过一段时间的抗生素治疗后，C57 BL/6小鼠的ID8（A）和ID8 VEGF（B）队列中的特定细菌菌株发生了变化。每组n=8只小鼠（HC：H2O顺铂，HP：H2O安慰剂，AC：ABX顺铂，AP：ABX安慰剂），每组每个时间点n=8只小鼠。    

图4 ABX治疗导致NSG小鼠肠道微生物组随时间推移发生微生物改变。

经过一段时间的抗生素治疗后，NSG小鼠的ID8（A）和ID8 VEGF（B）队列中的特定细菌菌株发生了变化。每组n=8只小鼠（HC：H2O顺铂，HP：H2O安慰剂，AC：ABX顺铂，AP：ABX安慰剂），每组每个时间点n=8只小鼠。    

5 ABX治疗未显著改变体外ID8或ID8-VEGF EOC肿瘤细胞的增殖    

为了确定肿瘤生长是否直接受到ABX与ID8和ID8-VEGF细胞系相互作用的影响，我们进行了组织培养分析。将不同浓度的ABX(甲硝唑、万古霉素、氨苄青霉素和新霉素)按小鼠实验中相同的比例分别与ID8和ID8-VEGF细胞系共培养。培养7天后，ABX处理的细胞与正常培养基中的细胞相比无明显差异。此外，与对照组相比，ABX处理后，顺铂对ID8或ID8-VEGF细胞的IC50没有变化。我们用来自H2O和ABX处理的小鼠盲肠的细菌培养物的条件培养基与ID8细胞进行共培养研究。没有发现ID8细胞生长或成球率的差异。    

6 抗生素治疗导致患者源性EOC肿瘤生长加速并降低其对顺铂的敏感性    

为了确保我们所观察到的表型并非同源EOC细胞系（ID8和ID8-VEGF）独有。我们采用人类衍生的OV81细胞系在NSG小鼠中重复了我们的研究范式。在使用ABX或对照水2周后，小鼠IP注射5×106个OV81细胞。为了监测这一小鼠队列的肿瘤生长，在IP注射之前，细胞被转导了荧光素酶报告基因。注射后2周，小鼠被随机分为4组（H2O赋形剂、H2O顺铂、ABX赋形剂和ABX顺铂），并按先前所述进行处理。小鼠通过活体成像系统（IVIS，Perkin Elmer）进行成像，并计算每秒总光子通量以确定总肿瘤负荷。总体而言，与赋形剂和顺铂治疗组的H2O对照组相比，当归一化为初始肿瘤负荷时，ABX治疗导致肿瘤总负荷显著增加。    

7 ABX治疗诱导NSG小鼠ID8 EOC肿瘤的干细胞表型    

为了研究ABX诱导的微生物组破坏对EOC肿瘤生长和对顺铂的敏感性的机制，我们检测了肿瘤和腹水中细菌的存在。我们在脑心浸液（BHI）制备的琼脂平板上培养H2O和ABX处理小鼠的肿瘤样本。然后将接种的平板在有氧和厌氧条件下培养4天。正如预期的那样，我们在H2O处理的样本中得到了细菌生长，但在ABX处理的小鼠的肿瘤中没有观察到细菌生长。这些发现与图3和图4的结果一致，表明肠道内的细菌减少，肿瘤也随之减少。为了阐明抗生素治疗对肿瘤细胞的影响及其在顺铂存在和不存在的情况下生长的机制，我们在实验终点(ID8细胞注射后8周)对来自H2O（安慰剂，顺铂)和ABX(安慰剂，顺铂)治疗的NSG小鼠的肿瘤进行了大量的RNAseq。利用DAVID软件对H2O安慰剂组和ABX安慰剂组（图5A）进行配对比较后，分析了前100个受影响最明显的基因的P值，以了解GO术语的富集情况。有趣的是，最富集的GO术语包括细胞分化、增殖和线性增加的癌症干细胞的运动活性（图5B）。我们确定，与H2O对照组相比，ABX治疗组中通常与癌症干细胞相关的基因也有所增加，包括SOX2、WNT7a、HOXb5、HOXb6、DLX5、MSX1、EFNA4、SALL1和PAX2基因。促进细胞分化的基因SHOX2和GATA5相互调控(图5C)。我们通过对DLX5、MSX1和PAX2进行qRT-PCR分析来验证RNA-seq数据（图5D）。基因集富集分析（GSEA）显示，与H2O处理的对照组相比，ABX处理的肿瘤中上皮间充质转化、通过TNFα的NFkB信号和缺氧均富集（图5E）。    

由于我们观察到基于肿瘤RNAseq的干细胞标志物增加，因此我们进行了自我更新检测，以评估接受和未接受顺铂治疗的H2O和ABX治疗小鼠肿瘤中的干细胞频率。尸检结束后，将每组肿瘤组织分离成单个细胞并进行有限稀释试验。在孵育14天后，我们确定了球体起始频率，这表明与H2O队列相比，来自ABX处理的BL/6小鼠的ID8细胞的球体起始频率显著增加，这在顺铂处理组中非常显著(图6A)。我们通过对治疗小鼠的qRT-PCR分析，验证了第二组小鼠中干细胞频率的变化(图6B-D)。我们确定ABX联合顺铂治疗增加了NANOG(图6B)、OCT-4(图6C)和SOX-2(图6D)的表达，其方式与球体分析平行。ABX对CSCs的影响在NSG队列中得到了复制，表明ABX治疗后干细胞数量增加，而顺铂可增强ABX治疗后的干细胞群(图6E)。值得注意的是，在NSG小鼠的H2O队列中发现CSCs对顺铂反应的增加，因为顺铂没有增加来自C57Bl/6J小鼠H2O队列的ID8细胞的干细胞形成频率(比较图6A和E)。    

图5 NSG ID8肿瘤转移至网膜的RNAseq显示了治疗组之间的差异表达基因。

A. ABX安慰剂组与H2O安慰剂组相比，按P值排序的前100个差异表达基因（DEGs）。B. ABX安慰剂组与H2O安慰剂组相比，富集的最显著的GO术语。C. ABX安慰剂组与H2O安慰剂组相比，富集的干细胞基因，按P值排序。D. 利用来自独立小鼠队列的肿瘤，通过RNAseq分析对DEG进行qRT-PCR分析。E. 具有代表性的GSEA图显示ABX比H2O处理的肿瘤富集的基因集，包括EMT、HYPOXIA、NOS和NFK途径。    

图6 ABX治疗小鼠的肿瘤球体起始频率增加，顺铂治疗后进一步增加。

A. 从经或未经顺铂治疗的C57BL/6J H2O和ABX处理小鼠的肿瘤中分离出的ID8肿瘤细胞被解离成单细胞，然后进行球状细胞分析以检测CSC频率。B-D. 经或未经顺铂治疗的C57BL/6J H2O和ABX处理小鼠的肿瘤分别进行RNA处理，并通过qRT-PCR对干细胞基因NANOG、OCT-4和SOX-2进行验证。E. 从经或未经顺铂治疗的NSG H2O和ABX处理小鼠的肿瘤中分离出的ID8肿瘤细胞被解离成单细胞，然后进行球状细胞分析以检测CSC频率。    

8 对照组小鼠的盲肠微生物移植(CMT)足以抑制ABX治疗后的EOC肿瘤进展和顺铂耐药    

我们测试了这样一个假设：ABX处理小鼠肠道菌群与H2O处理小鼠肠道菌群的再定植可以抑制EOC肿瘤的加速生长和顺铂耐药。按照图7A所述的研究范式，从H2O或ABX处理的小鼠中获取盲肠内容物。用ABX治疗的C57Bl/6J小鼠口服灌胃H2O或ABX治疗小鼠的盲肠内容物，然后用IP注射ID8 EOC细胞，每两周用IVIS成像监测肿瘤进展。终点标准被预先确定为：总肿瘤负荷>150 mm3，衰弱的腹水发展，和/或标准身体成分评分（BCS）<2。在ABX CMT治疗小鼠的终点开始时，所有组都比较了从基线开始的总肿瘤进展（图7B）。接受H2O CMT的小鼠的肿瘤负荷与未接受任何ABX治疗的小鼠相当，而接受ABX CMT的小鼠的肿瘤负荷与自始至终接受ABX的小鼠几乎相同。生存分析表明，ABX CMT治疗的小鼠对顺铂治疗无反应；细胞注射后，赋形剂组和顺铂组小鼠的中位生存期分别为61天和57天。H2O CMT治疗的小鼠对顺铂治疗敏感，赋形剂组和顺铂治疗组的中位生存期分别为83天和91天(图7C)。    

图7 H2O CMT可改善ABX对顺铂敏感性和肿瘤进展的影响。

A. 描述ABX治疗后粪便微生物移植的研究设计示意图。B. 基于发光(光子/秒)的肿瘤负荷的总体倍数变化，并根据肿瘤植入的基线检测进行校正(n=10/组)。C. ABX治疗的CMT小鼠与H2O治疗的CMT小鼠相比，不考虑顺铂治疗与否的生存分析。    

9 肠道衍生的微生物代谢物受到ABX治疗的抑制，并通过再定植恢复    

由于再定植抑制肿瘤生长和对顺铂的敏感性，我们筛选了从C57Bl/6J小鼠中收集的血浆样本，这些小鼠接受和不接受ABX以及接受和不接受顺铂治疗。通过质谱法（MS）对血浆样品进行了29种先前确定的肠道衍生代谢物的筛选。我们在H2O处理的小鼠中发现了被ABX抑制的吲哚-3-丙酸、硫酸吲哚酚和马尿酸（图8A-C）。我们接下来评估了CMT研究中的代谢物，发现用H2O CMT重新定植的ABX小鼠中，吲哚-3-丙酸和硫酸吲哚酚水平恢复到基线水平（图8A，B）。马尿酸水平在H2O CMT小鼠中没有恢复（图8C），表明它可能没有参与抑制卵巢癌在完整或CMT再定植肠道微生物组中的生长。这些结果确定了可能将肠道微生物组与腹膜中卵巢癌生长联系起来的候选肠道衍生代谢物。总之，我们的研究表明抗生素对肠道微生物组和微生物代谢物产生有害影响，进而对卵巢癌生长产生影响，并降低对化疗的反应（图8D）。ABX治疗小鼠的肿瘤表现出血管生成和肿瘤干细胞增加。

图8 ABX可以抑制小鼠血浆中肠道衍生的微生物代谢物，突出了ABX对EOC的影响。

来自H2O或ABX处理的C57BL/6J小鼠的血浆(不含或含顺铂)，然后对之前显示为肠道微生物衍生的29种代谢物进行质谱分析。A-C.显示吲哚-3-丙酸、硫酸吲哚酚和马尿酸的分析(n=14/组)。CMT研究血浆的处理同上，重点是吲哚-3-丙酸、硫酸吲哚酚和马尿酸(n=10/组)。单因素方差分析用于检验显著性。D.本研究结果表明，肠道微生物组对卵巢癌具有保护作用。广谱抗生素的使用会破坏微生物群落，减少微生物代谢物，从而导致卵巢癌生长和顺铂耐药不受抑制。在未使用抗生素的对照组小鼠的肠道细菌周围和血液循环中发现了微生物代谢物(如图中圆点所示)，并在接受抗生素治疗的小鼠中被抑制。应用广谱抗生素治疗的小鼠肿瘤表现出细胞增殖、血管生成和肿瘤干细胞增加。    

讨论

近年来，越来越多的证据表明肠道微生物组、癌变和对癌症治疗的反应之间存在关联。在临床前模型和患者队列中，已有研究支持与抗生素治疗相关的肠道微生物破坏可能对免疫检查点抑制剂和全身性抗癌药物(包括铂类化疗)的疗效产生负面影响。迄今为止，肠道微生物组对妇科恶性肿瘤患者化疗疗效的影响仍有待探索。在诊断为卵巢癌的女性患者中，铂类化疗仍然是原发和新复发卵巢癌的标准治疗。疾病预后和治疗效果取决于对铂类药物的敏感性，在积极治疗方案有限的情况下，铂类药物耐药预示着不良预后。提高对铂类药物的敏感性和防止耐药性的发生对于改善卵巢癌患者的治疗至关重要。    

本文描述的临床前研究表明，抗生素治疗和伴随而来的肠道微生物组变化可加速肿瘤生长、减弱顺铂敏感性和降低生存率。在接受ABX的小鼠中，16S rDNA分析表明，与对照组相比，肠道微生物组被显著抑制。无论是否接受顺铂治疗，ABX治疗均显著降低了粪便微生物群落的多样性。同样，培养的腹水(如果有的话)和ABX处理小鼠的肿瘤(包括顺铂处理)在BHI琼脂平板上在有氧或厌氧条件下培养72小时均未显示出细菌菌落。相比之下，接受H2O治疗的小鼠的肿瘤发现了细菌菌落。本研究结果证实了16S测序结果，即ABX治疗后细菌显著减少。ID8细胞与H2O和ABX处理小鼠盲肠的细菌培养条件培养基共培养，ID8细胞生长或球形频率无差异。这项分析排除了由于ABX长时间治疗而导致细菌渗漏到腹腔的可能性，并支持了我们的结论，即在完整的微生物组中，肠道衍生的抑制活性。    

ABX治疗导致化疗耐药和较差的总生存期。我们对来自ABX +顺铂队列的肿瘤的分析显示，基于TUNEL染色，细胞凋亡增加，这应该是导致抗癌活性的原因。在ABX和顺铂治疗的小鼠肿瘤中，我们观察到几种可能导致化疗耐药的机制，包括基于53BP1的DNA损伤减少，基于CD31的血管生成增加，以及基于来自治疗肿瘤细胞的自我更新的CSCs增加。ABX诱导小鼠肿瘤耐药的机制有待进一步研究。    

本研究发现，通过来自H2O处理小鼠盲肠的CMT恢复ABX处理小鼠的肠道微生物组足以提高总体生存率。此外，我们提供的证据表明，在H2O处理小鼠的血浆中发现了循环肠道衍生代谢物，并被ABX破坏，而通过盲肠微生物组的再定植恢复。这支持了肠道活性/代谢物在EOC中抑制肿瘤生长和维持化疗敏感性的作用。    

本研究的结果与调查肠道微生物组对铂类化疗和免疫检查点抑制剂治疗非妇科癌症的影响的研究一致。事实上，Routy等人的研究表明，对免疫检查点抑制剂的抗性与肠道微生物组的异常组成有关。通过ABX治疗破坏肠道微生物组后，对CpG-寡核苷酸免疫疗法和环磷酰胺的反应受到损害，这主要是因为细胞因子的产生减少，活性氧的产生降低，细胞毒性减弱。在另一项研究中，Iida等人证明，通过ABX破坏肠道微生物组，损害了铂类药物的反应，导致结肠癌和淋巴瘤动物模型的肿瘤消退和生存期降低。值得注意的是，Cho及其同事的研究表明，用ABX破坏肠道微生物组足以推迟诱发自发性卵巢癌的发展。    

Chen等人在他们的研究中使用了基因工程的自发性小鼠卵巢癌模型，并监测之前暴露于ABX后的肿瘤诱导。数据表明，ABX的破坏会对肠道和阴道微生物组产生长期影响，并与随后卵巢肿瘤的减少相关。这似乎与我们的发现形成对比。我们的研究在实施过程中存在差异，这可能是差异的原因。我们的研究利用了另一种实验范式，用C57BL/6J雌性小鼠进行类似的抗生素治疗，然后腹腔注射同源小鼠衍生的ID-8或ID-8 VEGF细胞系，以及人源的铂敏感的OV81高级别浆液性卵巢癌患者来源的异种移植模型。OV81有一个p53突变（R121S），并且不携带BRCA 1/2突变。模型和治疗范式的差异可能解释了我们各自研究中观察到的结果。总的来说，我们的研究和Chen及其同事的研究突出了阐明ABX的机制和影响的复杂性，以及延伸到微生物组对卵巢癌发展和化疗耐药的影响。在接受铂类化疗的非妇科癌症患者队列中也有类似的发现。在800名接受环磷酰胺或顺铂治疗慢性淋巴细胞白血病或淋巴瘤的临床试验的患者中，在化疗期间接受针对革兰氏阳性菌的ABX与治疗反应、复发时间和生存率的明显下降有关。这些发现表明，特定细菌群的存在可能对治疗反应至关重要。在本研究中，我们发现潜在的致病性Enterobacteriaceae和Parasutterella的相对丰度明显提高。值得注意的是，在接受顺铂治疗的动物中，与接受安慰剂的动物相比，这些细菌在没有附带性革兰氏阳性菌的情况下进一步增加。尽管尚未对癌症进行研究，但Parasutterella的丰度增加与肠道微生物组的失调和肝脏代谢的改变有关。    

本研究的发现确定了可能有助于抑制卵巢癌生长和对顺铂敏感的候选肠道微生物代谢物。在我们的代谢组学分析中发现了吲哚-3-丙酸和硫酸吲哚酚，并可能为建立肠道微生物组和卵巢癌之间的联系提供一个起点。未来的研究将集中在体外和临床前研究，以阐明这些候选代谢物或其他可能在抑制卵巢癌和化疗敏感性方面发挥的作用。    

我们确定，在微生物破坏的情况下，免疫系统的破坏并不会直接促进肿瘤生长或降低对铂类药物的敏感性。与对照组相比，在抗生素治疗后的小鼠腹腔液中没有观察到骨髓和淋巴细胞群的差异。我们承认巨噬细胞群体的重大贡献，它们没有包括在我们的流动小组中，并承认排除它们的局限性。我们的研究结果表明，在微生物群被破坏的情况下，对铂类化疗的反应降低；还揭示了顺铂和ABX在肠道菌群失调中的相互作用。    

本研究揭示了免疫系统在CSCs化疗诱导中的作用。我们发表的研究和其他研究表明，化疗药物可以在培养中诱导CSCs。这些研究是在培养中进行的，所以缺乏完整的肿瘤微环境。通过对免疫正常小鼠肿瘤的球体频率进行分析，我们发现H2O安慰剂和H2O顺铂处理的小鼠之间CSC频率没有差异。相比之下，在免疫缺陷小鼠中，我们发现与H2O安慰剂相比，H2O顺铂治疗小鼠的CSC频率明显增加。ABX治疗揭示了与免疫状态无关的顺铂诱导的干细胞增加。与H2O治疗组中免疫正常小鼠相比，免疫缺陷小鼠肿瘤中顺铂诱导的CSCs表明免疫监测在顺铂诱导的CSCs抑制中发挥作用。    

肿瘤干细胞数量增加与EOC铂类耐药之间的关系在文献中有很好的记载。具体来说，我们发现ABX组ID8肿瘤中SOX2、WNT7a、HOXb5、HOXb6、DLX5、MSX1、EFNA4、SALL1和PAX2的表达显著高于对照H2O组。SALL1与NANOG（一种公认的多能转录因子）相互作用，抑制分化。相反，促进分化的SHOX2和GATA5基因显著减少，进一步证明来自ABX小鼠的ID8肿瘤细胞比来自H2O处理小鼠的ID8肿瘤细胞更像干细胞，且未分化。通过对ABX组富集基因的KEGG通路分析，发现了包括P13K/AKT/mTOR和WNT在内的多条信号通路，这些信号通路目前正被研究作为卵巢癌治疗的靶点。我们需要进一步研究肠道微生物组与癌症干细胞相互作用的机制，以及这一机制如何驱动卵巢癌对铂类药物的耐药性。    

临床前研究表明，补充特定的细菌种类和FMT可以恢复几种癌症类型的化疗和免疫疗法的疗效。在Baruch等人开展的一项具有里程碑意义的I期临床试验中，10例PD-1难治性转移性黑色素瘤患者接受了微生物群清除，随后用缓解患者的粪便进行了FMT。值得注意的是，30%的患者恢复了临床缓解，其中1例完全缓解。因此，这些方法可能对妇科癌症患者产生类似益处，这是合理的。我们发现吲哚-3-丙酸和硫酸吲哚酚水平的变化提供了候选分子，可作为克服ABX加速卵巢癌生长和化疗耐药的潜在治疗方法进行测试。    

本研究旨在从本质上改变肠道微生物群组成，并为肠道微生物群对卵巢癌生长的影响提供概念验证。虽然该方法的目标是从根本上改变微生物群组成，并提供重要的概念验证结果，但这也有临床相关意义。例如，当患者首次入院时出现感染性休克或化疗期间出现中性粒细胞减少性发热时，通常根据经验开始使用革兰氏阳性、革兰氏阴性和厌氧菌覆盖的广谱抗生素，直至确定明确的感染源。在这些患者中，获得培养结果后(可能有3~4天)，抗生素治疗通常会降至单药治疗。抗生素预防对肿瘤预后的影响尚未得到充分探讨。在这些情况下，预防用药通常包括1~2剂抗生素治疗，因此目前尚不清楚这种治疗是否会导致微生物群发生明显变化。我们的研究组发表了与之同时进行的一项回顾性临床研究的结果(在引言中总结)，该研究表明，在铂类化疗期间，抗生素的使用与疗效降低、无进展生存期较差和总生存期较差相关，并且这种影响在接受针对革兰氏阳性菌的抗生素治疗的患者中最为明显。虽然这些临床发现可以提出假设，并且受相关粪便标本缺乏的限制，但它们提供了重要的临床背景，即抗生素治疗导致的微生物群改变与铂类化疗疗效的显著变化和较差的肿瘤预后相关。    

肠道微生物组对EOC患者铂类药物反应的影响具有重要的临床意义。在卵巢癌患者进行细胞减灭术或化疗期间，抗生素治疗往往不可避免。本研究的证据支持明智选择抗生素和给药持续时间的必要性，因为肠道微生物组的变化可能对肿瘤结局产生负面影响。临床医生应仔细权衡在铂类化疗期间开具广谱抗生素的好处和潜在的不良影响。抗生素治疗应在必要的最短期限内进行。虽然在化疗期间使用抗生素治疗往往是不可避免的，但提供者应了解机构的抗生素图谱和来自培养的定向数据来调整治疗。这也支持了这样一个概念，即应优先考虑采取措施来预防患有EOC的妇女的感染，从而避免抗生素治疗。最重要的是，了解肠道微生物群的破坏对EOC生长和铂类化疗的影响，为开发靶向治疗药物提供了潜力，旨在恢复完整的肠道微生物群，这可能是未来治疗卵巢癌和对抗铂类耐药的有效策略。    

结论

本研究发现，在卵巢癌临床前模型中，抗生素治疗导致的肠道微生物群破坏和肠道微生物代谢物减少可促进肿瘤生长，并降低对铂类化疗的敏感性。我们需要进一步研究肿瘤微环境，特别是肿瘤干细胞，如何与肠道菌群通讯，从而驱动卵巢癌对铂类药物的耐药性。这些问题的答案将为微生物导向的干预措施可否影响患者对铂类化疗的反应提供重要见解。