邹嘉琪、康可人：传染病快速诊断的发展与应用

临床实验室            

本文刊载于《临床实验室》杂志2022年11月刊专题“POCT专刊”-「述评」版块

作者：邹嘉琪1  康可人1*

单位：1 广州万孚生物技术股份有限公司，广州510641

*通讯作者：广东省即时检测（POCT）企业重点实验室，广州510000

大多数传染病都是由病原微生物引起的。床旁检测（POCT）在医疗服务现场和资源有限的情况下能够提供快速的“现场”结果，为后续治疗提供及时和适当的支持。本文主要概述了传染病POCT应用现状、传染病POCT的生物标志物以及传染病POCT技术的最新进展。

传染病POCT应用现状

1 疟疾

在热带地区每年有超过3亿患者患有疟疾。疟疾的常规诊断方法是以形态学检测为主的血涂片显微镜检查和以病原体核酸为检测目标的PCR法。但这种方法需要精密可靠的设备和训练有素的操作人员。基于分子免疫学原理的疟疾诊断试剂盒由于快速简便，无需大型仪器；基于胶体金免疫层析技术的疟疾诊断试剂盒因其灵敏度和特异性高，性能稳定，操作简便快速，无需专业人员操作，更适合应用于基层医疗机构和现场工作中使用。  

2 HIV

HIV的实验室检测主要包括HIV抗体检测、核酸检测和抗原检测等。其中，HIV1/2抗体检测是HIV感染诊断的金标准，常规的抗体检测包括酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹试验，ELISA灵敏度高，因此ELISA阴性通常足以排除HIV感染；但ELISA阳性时，通常需要免疫印迹试验来确认，因其具有极高的特异性。目前，HIV快速检测显示出与标准HIV检测相当的灵敏度和特异性，如Alere的Determine HIV 1/2 、万孚生物的HIV快速诊断试剂等，均可在POCT环境中检测HIV病毒。目前较为突出的是第四代HIV检测，它在第三代的基础上增加了p24抗原检测，也称为HIV联合检测，有可能缩短检测窗口期，并可在原发感染期间检测是否存在HIV。近年来，HIV自我检测（HIVST）也在逐渐普及。今年7月，MedAccess宣布与CHAI（克林顿基金会）、万孚生物达成合作，携手为中低收入地区提供HIV自测产品，惠及更大范围的人群，以实际行动支持全球艾滋防控。  

3 HPV

HPV是最常见的性传播病毒之一。根据WHO数据，全球每年新增宫颈癌病例53万，约25万女性因宫颈癌死亡。宫颈癌是一种可预防、可治疗的疾病， HPV的 DNA检测、巴氏细胞学检查、阴道镜检查和活检是目前宫颈癌筛查的金标准。HPV筛查和早期发现在宫颈癌预防中的关键作用。根据WHO最新发布的《宫颈癌前病变筛查和治疗指南》，推荐HPV DNA检测作为首选筛查方法， HPV DNA检测具有更好的灵敏度和特异性。  

4 登革热和埃博拉病毒

登革热是一种通过受感染蚊子的叮咬传播给人类的病毒感染。目每年估计有3.9亿新感染者。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是诊断登革热感染的金标准，但需要专业设备及操作人员。血清学方法，如ELISA，可通过检测抗登革热抗体，IgM存在表明最近发生了登革热病毒感染；IgG存在表明以前有过感染。而且登革热防疫的黄金窗口期仅2周左右，商业化生产的快速诊断试剂盒是通过检测病毒产生的蛋白质（称为NS1）来检测登革热，这种方法只需20分钟就能确定结果。此外，TaqMan探针实时荧光PCR检测登革热 RNA，是一种灵敏、特异、快速、低污染的登革热 RNA检测方法，可定性或定量检测登革热患者早期血清中的DENV。  

埃博拉病毒病病死率高达90%。及时诊断对于确保实施防疫措施尤为重要。目前的实验室检查主要包括病原学检测和血清学检测。病原学检测是采用分子杂交、RT-PCR等方法直接检测埃博拉病毒核酸；血清学检测是采用ELISA捕获法和ELISA间接法检测患者血清中病毒特异性IgM和IgG 抗体。目前已开发出抗原快速检测产品（Ag-RDT），Broadhurst等人比较了ReEBOV抗原快速检测试剂盒与金标准RT-PCR检测埃博拉病毒的现场性能，Ag-RDT的灵敏度显示为100%[95% CI 87.7-100]。一种新的策略将RDT与确认性PCR测试相结合被认为优于单独使用PCR测试或RDT测试，并将使爆发规模减少三分之一。

5 结核病

结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。据 WHO 估计，2016 年约有 1040 万新发结核病 (TB) 病例，其中诊断出的病例不到 64%。目前结核分枝杆菌诊断主要检测方法有结核菌素皮试、涂片、镜检、分枝杆菌培养、组织病理、结核抗体检测、结核PCR检测等。其中，结核分歧杆菌培养是金标准。2010年12月，WHO批准了由Alland等人开发的POCT产品Xpert® MTB/RIF检测。该方法使用基于试剂盒的集成微型PCR系统，无需专业操作人员，可在90分钟内从未处理的痰液样本中获得检测结果。还有被WHO认可的检测工具，如尿侧流脂阿拉伯甘露聚糖（LF-LAM）和环介导等温扩增（TB-LAMP）等。  

6 新冠病毒

新冠病毒（SARS-CoV-2）自2020年爆发以来，已在全球范围内持续蔓延。新冠检测有三大类：抗原、核酸和抗体。其中，RT-PCR是SARS-CoV-2感染检测的金标准，但在资源匮乏的地区很难普及。目前，经我国NMPA批准的Ag-RDTs共34款，系统综述和Meta分析显示，抗原快速检测对SARS-CoV-2核酸扩增循环数（Ct）＜20、＜25、≥25、和≥30样本的总体灵敏度分别为96.5%、95.8%、50.7%和20.9%。此外，市面上还有快速核酸和检测产品助力新冠检测，如赛沛公司的Xpert Xpress SARS-CoV-2、雅培的ID NOW快速检测系统等。    

传染病POCT生物标志物

生物标志物（Biomarker）可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

1 病原体核酸

几乎所有的传染病都是由携带核酸的病原体引起的。使用病原体核酸作为生物标志物的唯一缺点是无法区分病毒感染和定植。目前已开发了多种方法对核酸检测进行优化，比如恒温扩增法代替传统PCR，或使用集成微流控装置简化实验程序等，有效简化了繁琐的步骤，缩短了结果报告的时间。  

2 抗体

在感染过程中，免疫系统会产生大量抗体，抗体水平可能远高于病原体水平。在整个感染过程中抗体水平可能保持较高水平，而在感染后期抗原水平可能会显著下降。因此在这种情况下，抗体对传染病的诊断更有用。但当抗体水平与感染阶段没有很好的相关性时，抗体检测不适合用于传染病的诊断。  

3 病原体蛋白

所有引起传染病的病原体都携带蛋白质，如衣壳蛋白和包膜蛋白。如SARS-CoV-2的核衣壳蛋白（N蛋白）是理想的抗原检测靶标，市面上大多数抗原检测试剂以N蛋白为靶标，具有较高的检测敏感性和特异性。  

4 循环microRNA

MicroRNAs（miRNAs）具有转录后调节基因表达的功能。超过60%哺乳动物的mRNA受相应miRNA的调控。miRNA在感染期间的宿主免疫反应中也发挥着关键作用，已知miRNA作为细胞间通讯的信使通常被释放到细胞外环境，尤其是免疫细胞。虽然细胞外miRNA网络的确切功能仍在研究中，但利用循环miRNA表达特征作为生物标志物监测病理状态的潜力已引起越来越多的关注。

传染病POCT技术的新进展

目前，应用于传染病诊断领域的POCT产品主要有抗原快速检测（RDT），快速核酸检测和快速免疫诊断（如抗体检测）等。过去几十年中，开发用于传染病诊断的POCT取得了重大的技术进步，如侧向免疫分析、微流体、等离子体技术等。其中，微流体被认为是最有前途的解决方案之一。

1 微流体技术

微流体技术是研究可以通过使用微小尺寸的微小通道（通常为几十到几百微米）来处理少量流体的技术。通过微流体技术，样品和试剂可以在特定的微腔室中以精确控制的方式进行运输、混合和反应，是POCT测试开发的理想平台。纸基微流体被认为是一种低成本且用户友好的 POCT 传染病检测技术。此外，比色读数的方式也使得它在许多资源有限的环境中尤其有用。  

2 等离子体技术

等离子体学研究光与金属纳米材料导电电子之间的相互作用。常见的等离子体金属包括金、银和铝，各种等离子体纳米材料因其无标记性、光学可协调性和对周围介质的高灵敏度而被设计和用于POCT产品的制作。高灵敏度光学传感器的发展进一步推动了等离子体应用的快速发展。  

LSPR依赖于等离子体纳米材料对折射率变化的高灵敏度，目前已用于使用未经处理的全血进行无标记、无荧光和可重复的HIV病毒载量检测。等离子纸LSPR装置也被证明可选择性且敏感地检测蛋白质生物标志物，非常适合在资源有限的情况下诊断感染性疾病。

展望  

虽然一些生物标志物已作为传染性疾病POCT检测的靶点，但仍需要挖掘灵敏度和特异度更高的生物标志物。对单一传染性疾病的一组生物标志物进行系统表征可能是未来生物标志物筛选的有用方法。由于许多传染病可能具有相似的临床症状，因此也非常需要具有多重功能的POCT检测产品。

• 更多内容及作者简介，点击文末左下角阅读原文，进专题查看

-End-

题图 | veer.com

排版 | 张宁

审校 | 方研

版权归《临床实验室》杂志所有，转载合作请联系小编，谢谢